Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz
Summary
Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.
Abstract
Özel bağ ile uyarıldıkları zaman koku duyu nöronlarının fizyolojik tepkilerini (OSN) analiz koku tahrikli davranışları ve modülasyon temelini anlamak önemlidir. Bu kodlama özellikleri koku molekülleri ve koku reseptörü (OR) arasındaki ilk etkileşim ağır bağımlı OSNs olarak ifade edilmiştir. ifade YA kritik kimliği, özgünlüğü ve ligand spektrumu. OR ligandı bulmak için olasılık epitel içinde rastgele seçilen bir OSN çok düşüktür dile getirdi. Bu sorunu çözmek için, bu protokol, genetik olarak tanımlanmış ORs promoterinin kontrolü altında floresan protein GFP ifade isim levhası fareler kullanır. OSNs komşu hücrelerin olgunlaşması ve fonksiyonu etkileyen ile burun boşluğuna astar sıkı ve organize epitel yer almaktadır. Burada OSNs e özelliklerini sağlam bir koku epiteli izole ve patch-kelepçe kayıtları ile kaydetmek için bir yöntem tariftanımlanan koku reseptörü xpressing. protokol komşu dokuya etkisi tutarken tek OSN membran özelliklerini karakterize sağlar. Patch-kelepçe sonuçlarının analizi ligand / VEYA etkileşimleri, iletim yollarının ve farmakoloji, OSNs 'kodlama özellikleri ve membran düzeyde modülasyon kesin miktarının verir.
Introduction
Koku alma duyu nöronları (OSN) koku algı ilk adımı temsil etmektedir. Kemirgenlerde burun boşluğunu çevreleyen koku epiteli bulunan beyinle kendi akson yoluyla gönderilen aksiyon potansiyelleri içine koku kimyasal bilgi dönüşümü. Daha iyi koku kodlama mekanizmaları anlamak için, OSNs iletimi ve membran özelliklerini karakterize etmek gereklidir. Yakın zamana kadar, memeli OSNs özelliklerini karakterize etmek için kullanılan teknikler çok ayrışmış OSNs 1-4 üzerinde gerçekleştirilmiştir. ayrışma süreci çevrelerinden OSNs boşaltmak için çeşitli mekanik ve kimyasal (yani enzimler) süreçleri kullanır. Bu işlemler, kayıtlar için uygun bir hücre, düşük uyarmaktadır. Bu az sayıda GFP etiketli hücrelerin durumunda daha da kritik öneme sahip olabilir. Aynşması da OSNs ve Surviv artırabilir koku epitel başka hücreler arasındaki yerel hücre-hücre etkileşimleri ortadan kaldırırEl ve OSNs 'özelliklerinin modülasyonu. Ayrışma işlemini atlamak için, sağlam bir preparat 5 geliştirilmiştir.
Her OSN büyük bir çoklu gen ailesi 6 arasından seçildiği (OR), bir koku reseptörü ifade eder. Fare ana koku epiteli olarak ifade 1,000 OR ~ vardır. Nedeniyle vahşi tip hayvanlarda OR çok sayıda, büyük ihtimalle aynı ifade OSNs kayıt YA çok düşük etmek. Bu sınırlamaları aşmak için, gen hedeflenen fareler mevcut olduğu bir tespit VEYA floresan proteini 7-9 ile etiketlenmiş ifade tüm OSNs. Bu etiketli OSNs ayrışmış hazırlıkları Daha önce de belirttiğimiz sakıncaları ile 7,10,11 fonksiyonel analiz yapmak için kullanıldı. Genetik etiketli farelerden alınan sağlam bir epitel hazırlık 5 Dolayısıyla bu sorunları circumvents. Vi yakın olarak bir ortamda tam olarak tanımlanmış ORs ifade OSNs aktivitesi izlenmesine olanak sağlarmümkün olduğunca vo. Ayrıca, OSNs patch-kelepçe kayıtları da zar özellikleri, iletim yolu farmakoloji, ligand / VEYA etkileşimlerinin hassas analiz sağlar. Bütün bu konular pek dışı kayıtları kullanılarak analiz edilebilir. Biz koku reseptörü SR1 ve MOR23 12,13 ifade OSNs yanıtları izlemek için bu tekniği kullanılır. teknik fizibilite nöronlar 15,16 ifade OSNs 14 eksprese eden MOR23 üzerinde diğer gruplar yanı sıra, diğer ORs ile teyit edilmiştir. OSNs tanımlanmış bir nüfus izleme 17 yaşlanma, böyle bir gelişme 14 gibi pek çok farklı bağlamlarda özelliklerinin analizi yol açabilir, odorant indüklenen plastisite 18 ve 15 kodlama koku odorant reseptörün dizilimindeki rolü. Bu protokol, böylece zar düzeyinde tanımlanan OSNs fonksiyonel özelliklerini izlemek için güçlü bir araç sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
doğru, sağlıklı OSNs özelliklerini izlemek için bu protokolün yeteneği hazırlık kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. Bu nedenle, diseksiyon adımlar önemlidir. Önce kalite (pH, osmolarite), oksijenasyon ve sıcaklık (buz-soğuk ama dondurulmuş değil) diseksiyon orta dikkat etmek önemlidir. İkincisi, diseksiyon araçları ile epitel manipülasyon olarak zarar görmemesi için mümkün olduğunca sınırlı olmalıdır. Son olarak, mümkün olduğunca büyük OSN popülasyonu erişmek amacıyla, müm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil Régional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Université de Bourgogne (BQR program).
Materials
| heavy equipment | |||
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| recording electrodes /system | |||
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | warner instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride di hydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| MethylSulfoxide | Sigma-Aldrich | 47,135-6 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
Referências
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by ‘IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
