Summary

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Published: April 22, 2015
doi:

Summary

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Abstract

Yetişkin nöron yeni nöronlar giderek kararlı ara progenitör alt tipleri ile aktive edilmiş bir nöral kök hücre elde edildiği yüksek ölçüde düzenlenmiş bir çok-aşamalı süreçtir. Bu alt-tiplerin her biri, birlikte, özel morfolojik kriterlere göre tespit edilmek için kullanılabilen spesifik moleküler markörlerin bir dizi ifade eder. Tipik haliyle, immünofloresan teknikler ekso- ya da endojen çoğalma işaretleri ile kombinasyon halinde alt tip-spesifik antikorlar içeren uygulanır. Biz burada yetişkin hipokampal nöron tüm aşamalarında saptanması ve ölçülmesi için yöntemler immün tarif. Bu timidin analogları, transcardial perfüzyon, doku işleme, ısı kaynaklı epitop alma, ABC immünohistokimya, çoklu dolaylı immunofloresan, konfokal mikroskopi ve hücre ölçümü uygulaması içermektedir. Ayrıca biz sorunları u circumvents sıralı birden immunofloresans protokolü sunuyoruzsually aynı konak türlerinde kaldırdı birincil antikorlar kullanılarak ihtiyacı doğan. Tek bir bölüm içinde bir çoğalma işareti ile birlikte tüm hipokampal progenitör alt tiplerinin doğru belirlenmesini sağlar. Bu teknikler paralel farklı progenitör alt tiplerinin düzenleme, beyin patolojileri katılımlarını ve spesifik beyin fonksiyonları rollerini incelemek için güçlü bir araçtır.

Introduction

İki beyin bölgeleri kurucu yaşam boyunca yeni nöronlar oluşturmak, lateral ventriküllerin subventriküler bölge ve hipokampusün (DG) subgranular bölge (SGZ). Yeni doğan nöronlar nöral progenitör hücrelerden elde ve olgunluğa 1,2 ulaşmadan önce morfolojik ve fizyolojik gelişimin farklı aşamalarında gitmek. Yavaş bölünmesi radyal glia-benzeri kök hücre (tip 1) transit ardışık aşamaları ara progenitör hücrelerin ortaya yükselterek. daha farklılaşmamış alt tipi (Tip 2a ve tip 2b) kısa teğet süreçleri ile düzensiz bir şekle sahiptir. Onlar (dendritler moleküler tabakası doğru genişletilmiş) ile giderek olgunlaşmamış nöronların olmak için hücre döngüsünü çıkmak ve nihayet hipokampal ağ gibi olgun granül hücreleri içine entegre Nöroblastlar (tip 3) oluşturur. Dolayı özellikle fizyolojik özellikleri bu hücreler gelişmiş plastisite 3 sugges ile devreyi sağlamakting hipokampustaki benzersiz bir rolü. Aslında, son on çalışmaları yetişkin nöron mekansal bellek, desen ayırma ve duygusal davranış 4,5 katkıda önemli kanıtlar oluşturdu.

Yetişkin nöron farklı yaklaşımlar kullanılarak incelenebilir. Timidin analogları hücre döngüsünün S-fazında DNA içine dahil ve yeni doğan hücrelerin 6-8 doğum partner, miktar ve kader analizi sağlar. Farklı timidin analogları (örneğin, CldU, edu veya DUK) sıralı uygulama hücre yenileme ya da bir deney 9 sırasında farklı zaman noktalarında doğan hücre popülasyonlarının incelemek için kullanılabilir. Bir alternatif olarak, hücre proliferasyonu için endojen işaretleyici Ki67 olup. Hücre döngüsü (G1, S, G2, E) dinlenme aşamasında dışında (G0) ve G1 10,11 başında her safhasında hücrelerin bölünmesi ile ifade edilir. Yetişkin dentat yenidoğan hücre popülasyonlarının fenotipi analiz etmekE girus çeşitli safha spesifik moleküler markörler GFAP, Nestin, DCX ve neuN 1,6 olarak kullanılabilir. GFAP erişkin astrositlerin bir göstergesi, aynı zamanda, yetişkin önbeyin radyal glial benzeri hücrelerde ifade edilir. Nestin radyal glia-benzeri hücreler ve erken orta projenitör hücrelere özgü bir ara filamenttir. DCX ara progenitörlerle nöroblast- ve olgun nöronlarda ifade edilen bir mikrotübüle bağlı bir proteindir. + Nestin türü 2a (GFAP tip 1 (GFAP + Nestin +, DCX): Bu üç işaretleri ve dört ayrı progenitör hücre alt tipleri tespit edilebilir etiketli hücrelerin morfolojik özellikleri (eş) ifadesi dayanarak , DCX -), tip 2b (GFAP -, Nestin +, DCX +) ve tip 3 (GFAP -, Nestin DCX +) 1. Birlikte postmitotik nöronların ifade neun, ile DCX Eş-etiketleme immatür farklılaşmasını izin verire (DCX + neun +) ve olgun (DCX neun +) granül nöronlar.

Yukarıda belirtilen belirteçler sıklıkla yeni doğmuş hücrelerin sayısını ve kimliğini analiz etmek üzere immünoflüoresan ko-etiketleme ve daha sonra konfokal mikroskopi için kullanılır. Bu, tipik olarak, istenmeyen antikor çapraz reaktivite önlemek için farklı bir ev sahibi türünden antikorların gerektirir. Ancak nöron araştırma için uygun bir temel antikorların büyük bir kısmı ya da tavşanlar ya da fareler (örneğin, fare α-BrdU, fare α-neun, tavşan α Ki67, tavşan α-GFAP) yetiştirilir. Bu, tek bir dilim değerlendirilebilir antijenlerin sayısı ve kombinasyon halinde ciddi kısıtlamalara yol açar. Bu da birden fazla boyamaları girmelidirler gibi yalnızca boyama sarfedilen güç artar, ama aynı zamanda sonuçların güvenilirliğini tehlikeye atabilir. Bununla birlikte, bazı antijenler, formalin tespit kaynaklı epitop maskeleme (ör Ki67 duyarlıdırlar, Nestin). Biz burada klasik tek ve çoklu immün protokolleri değişiklikleri tanımlamak (örneğin, epitop alma, birden fazla sıralı immun, Nestin-GFP transgenik farelerin 12 kullanımı) bu sorunların çoğunun üstesinden. Özel olarak, sıralı çok sayıda imüno protokol antikorların bir kısmı da, ev sahibinden türemiş bile, dört farklı antijenlere karşı boyama sağlar. Bu aynı anda Tip 1, Tip 2a, tip 2b ve tip 3 projenitör hücrelerin saptanmasını, hem de tek bir bölüm içinde çoğalma aktivitesi sağlar.

Protocol

NOT: yaşayan hayvanları kapsayan tüm işlemler EC direktifi 86/609 / EEC sayılı laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı ile ilgili kurallar ve yerel etik kurul (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) tarafından onaylanan uygun olarak yapılmıştır. Timidin Analoglarının 1. periton içine enjeksiyon Enjeksiyondan önce hayvanlar gün tartılır. Bir sonraki gün aynı zamanda, bir 10 mg / ml stok çözeltisi, bireysel ağırlı…

Representative Results

Biz ölçmek ve doğum sonrası ve yetişkin hipokampus yenidoğan hücreleri karakterize etmek yukarıda açıklanan yöntemleri uygulamalı. Bu nedenle, vahşi tip ve nöron-eksikli siklin D2 nöron oranı (yani, zenginleştirilmiş bir ortam, EE) 13,14 etkilediği bilinen koşullar altında muhafaza (Ccnd2 KO) fareler nakavt kullanılır. Ki67, BrdU, CldU veya DUK ya karşı immünohistokimyasal DAB boyama sürekli yabanitipte ve Ccnd2 KO farelerde (Şekil 3) <su…

Discussion

Kantifikasyon ve yenidoğan hücrelerin alt popülasyonlarının belirlenmesi yetişkin nöron araştırma merkezi konudur. Yetişkin nöron spesifik aşamalarında ifade proteinlere karşı çoğalma belirteçleri ve antikorlar birleştiren bu alt popülasyonlar immünohistokimyasal algılanmasını sağlar. Antikorlar ya da antikor kombinasyonlarının bazı spesifik boyama koşulları gerektirir.

Sentetik timidin analogları ile hücrelerin bölünmesi Etiketleme hala yetişkin hipokampal…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).

Materials

Name Company Catalog Number Comments & Dilutions
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU Sigma-Aldrich C6891
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU MP Biomedicals 2105478
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU MP Biomedicals 2100357
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis Piramal Healthcare 700211
Paraformaldehyde powder (PFA) Riedel-De Häen 16005 toxic, flammable
Perfusion pump PD5206 Heidolph Instruments 523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm  Thermo Fischer Scientific 06409-13
Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm Agnthos 1036
Freezing microtome Microm HM 400 Thermo Fischer Scientific
24 Well Cell Culture Multiwell Plates Greiner Bio-One 662160
Immunohistochemistry
Tefal Vitacuisine Steamer Tefal VS 4001
Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates Corning 3479
Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates Corning 3477
Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Corning 3521
Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Corning 3520
Vectastain Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) Sigma-Aldrich D-5637 carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Primary antibodies
rabbit IgG1 α-Ki67 Novocastra/ Leica Biosystems NCL-L-Ki67MM1 DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
rabbit α-GFAP, AS-3-GF Synaptic Systems 173 002 1:500
goat IgG (H+L) α-GFP Acris Antibodies R1091P 1:300
mouse IgG1 α-nestin Abcam ab6142 1:200; requires epitope retrieval
guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin Merck Millipore AB2253 1:500
rat IgG2a α-BrdU (ascites) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030CX for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
rat IgG2a α-BrdU (purified) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030   for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
mouse IgG1ĸ α-BrdU BD Biosciences 347580 for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
mouse IgG1 α-NeuN Merck Millipore MAB377 1:500
Secondary antibodies
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin Dianova 711-065-152 1:500
donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin Dianova 712-065-150 1:500
donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin Dianova 715-065-151 1:500
goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 1:250
donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11055 1:250
donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment Dianova 715-097-003 1:100
donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 715-605-151 1:250
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 706-605-148 1:250
donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 712-295-150 1:250
donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 711-295-152 1:250
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 706-296-148 1:250
Streptavidin-Rhodamine Red-X  Dianova 016-290-084 1:500
goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA Dianova 111-155-144 1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342 Molecular Probes H3570 1:1000
DAPI Molecular Probes D1306 1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) Dianova 715-007-003 1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) Dianova 711-007-003 1:20
Normal donkey serum Merck Millipore S30
Normal rabbit serum Dianova 011-000-010
Normal goat serum Dianova 005-000-001
Bovine Serum Albumine Sigma-Aldrich A7906
Histology
Cresyl violett Sigma-Aldrich C5042
Neo-Clear Merck Millipore 109843 non-toxic xylene substitute
Neo-Mount Merck Millipore 109016 permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2 Carl Zeiss Microscopy
LSM 710 Carl Zeiss Microscopy

Referências

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).

Play Video

Citar este artigo
Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (98), e52551, doi:10.3791/52551 (2015).

View Video