La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
Neurogénesis adulta es un proceso multi-etapa altamente regulado en el que las nuevas neuronas se generan a partir de una célula madre neural activado a través de cada vez más comprometida subtipos progenitoras intermedias. Cada uno de estos subtipos expresa un conjunto de marcadores moleculares específicos que, junto con los criterios morfológicos específicos, pueden ser utilizados para su identificación. Por lo general, las técnicas de inmunofluorescencia se aplican implica anticuerpos específicos de subtipo en combinación con marcadores de proliferación exo o endógenos. Nosotros describimos en la presente memoria métodos para la detección y cuantificación de todas las etapas de neurogénesis en el hipocampo adulto immunolabeling. Estos comprenden la aplicación de los análogos de timidina, perfusión transcardial, procesamiento de tejido, de recuperación de epítopo inducida por calor, ABC de inmunohistoquímica, inmunofluorescencia indirecta múltiple, microscopía confocal y cuantificación de células. Además se presenta un protocolo de inmunofluorescencia secuencial múltiple que evita problemas usually que surge de la necesidad de la utilización de anticuerpos primarios planteados en la misma especie hospedadora. Se permite una identificación precisa de todos los subtipos progenitoras del hipocampo, junto con un marcador de proliferación dentro de una sola sección. Estas técnicas son una poderosa herramienta para estudiar la regulación de los diferentes subtipos progenitoras en paralelo, su implicación en patologías cerebrales y su papel en las funciones específicas del cerebro.
Introduction
Dos regiones del cerebro generar nuevas neuronas constitutivamente largo de la vida, la zona subventricular de los ventrículos laterales y la zona subgranular (SGZ) del giro dentado del hipocampo (DG). Las neuronas recién nacidas se derivan de las células progenitoras neurales y pasan por diferentes etapas de desarrollo morfológico y fisiológico antes de alcanzar la madurez 1,2. Desde un dividiendo lentamente-glía radial como células madre (tipo 1) etapas consecutivas de tránsito amplificar surgen células progenitoras intermedias. Los subtipos más indiferenciados (tipo 2a y 2b tipo) tienen una forma irregular con cortos, procesos tangenciales. Generan neuroblastos (tipo 3) que salen gradualmente del ciclo celular para convertirse en neuronas inmaduras (con dendritas extienden hacia la capa molecular) y finalmente integrar en la red del hipocampo células granulares como maduros. Debido a sus características fisiológicas estas células proporcionan los circuitos con una mejora de la plasticidad 3 sugeting un papel único en la función del hipocampo. En realidad, los estudios de la última década generado evidencia sustancial de que la neurogénesis adulta contribuye a la memoria espacial, la separación patrón de comportamiento emocional y 4,5.
Neurogénesis adulta se puede estudiar utilizando diferentes enfoques. Análogos de timidina incorporan en el ADN durante la fase S del ciclo celular y permiten nacimiento de citas, la cuantificación y el destino análisis de las células recién nacidos 6-8. La aplicación secuencial de los diferentes análogos de timidina (por ejemplo, CldU, EdU o IDU) puede ser usado para estudiar la renovación celular o poblaciones de células nacidos en diferentes puntos de tiempo durante el curso de un experimento 9. Una alternativa, marcador endógeno para la proliferación celular es Ki67. Se expresa en las células en división durante todas las fases del ciclo celular (G1, S, G2, M) excepto la fase de reposo (G0) y el comienzo de G1 10,11. Para analizar el fenotipo de las poblaciones de células recién nacidas en el adulto dentate gyrus varios marcadores moleculares específicos de la etapa se pueden utilizar como GFAP, nestina, DCX y NeuN 1,6. GFAP es un marcador de astrocitos maduros pero también se expresa en células gliales-como radiales en el cerebro anterior adulto. Nestin es un filamento intermedio específico para células gliales como radiales y células progenitoras intermedios tempranos. DCX es una proteína asociada a microtúbulos expresado en progenitores intermedios, los neuroblastos y las neuronas inmaduras. Sobre la base de la (co) expresión de estos tres marcadores y las características morfológicas de las células marcadas cuatro subtipos de células progenitoras se pueden identificar diferentes: tipo 1 (GFAP +, nestina +, DCX -), tipo 2a (GFAP -, nestina + , DCX -), el tipo 2b (GFAP -, nestina +, DCX +) y tipo 3 (GFAP -, nestina -, DCX +) 1. Co-etiquetado de DCX junto con NeuN, que se expresa en las neuronas postmitóticas, permite la diferenciación de immature (DCX +, NeuN +) y maduros (DCX -, NeuN +) neuronas granulares.
Los marcadores mencionados anteriormente se utilizan con frecuencia para inmunofluorescencia co-etiquetado y microscopía confocal posterior para analizar el número y la identidad de las células recién nacidos. Esto requiere típicamente anticuerpos de diferentes especies huésped para evitar anticuerpo no deseado reactividad cruzada. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos primarios adecuados para la investigación neurogénesis resucitan ya sea en conejos o ratones (por ejemplo, ratón α-BrdU, ratón α-NeuN, conejo α-Ki67, conejo α-GFAP). Esto conduce a graves limitaciones en el número y la combinación de antígenos que se pudieron evaluar en una sola porción. Esto a su vez no sólo aumenta el esfuerzo de tinción, como múltiples coloraciones tienen que ser realizadas, pero también podría comprometer la fiabilidad de los resultados. Además, algunos antígenos son susceptibles a la formalina enmascaramiento epítopo inducida por la fijación (por ejemplo, Ki67, Nestina). Esta revisión se describen las modificaciones de los protocolos immunolabeling múltiple y simple clásicos (por ejemplo, la recuperación de epítopo, inmunotinción secuencial múltiple, uso de nestin-GFP ratones transgénicos 12) que superar muchas de estas cuestiones. En particular, el protocolo de inmunofluorescencia secuencial múltiple permite tinción contra un máximo de cuatro antígenos diferentes, incluso si una parte de los anticuerpos se deriva de la misma máquina. Esto permite la detección simultánea de tipo 1, tipo 2a, tipo 2b y tipo de células progenitoras 3, así como su actividad proliferativa dentro de una sola sección.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cuantificación e identificación de las subpoblaciones de células recién nacidas es un tema central en la investigación neurogénesis adulta. Combinando marcadores de proliferación y anticuerpos contra las proteínas expresadas durante etapas específicas de la neurogénesis adulta permite la detección inmunohistoquímica de estas subpoblaciones. Algunos de los anticuerpos o combinaciones de anticuerpos requieren condiciones de tinción específicas.
Etiquetado de células que se di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
Referências
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