This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.
गिल ionocytes (आईसीएस) मछली में आयनिक नियमन के लिए कार्यात्मक इकाइयां हैं। वयस्कों में, वे गिल की filamental और तहदार epithelia पर पाए जाते हैं, जहां इस तरह के ना +, सीएल के रूप में वे परिवहन आयनों – आयन चैनल, पंप और एक्सचेंजर्स की एक किस्म के माध्यम से और सीए 2 +। teleost गिल बाहर से, जिह्वा-ग्रसनी (ग्यारहवीं) और वेगस (एक्स) तंत्रिकाओं (छठे) चेहरे द्वारा innervated है। नौवीं और दसवीं नसों भी गिल आईसी स्फूर्तिदान के बाह्य स्रोत हैं। इधर, स्फूर्तिदान, प्रसार और आईसीएस के वितरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल दो तकनीकों वर्णित हैं: एक समय अंतर धुंधला तकनीक और एक पूर्ण द्विपक्षीय गिल वितंत्रीभवन तकनीक। संक्षेप में, सुनहरी एक महत्वपूर्ण mitochondrion-विशिष्ट डाई को उजागर कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, Mitotracker लाल) लेबल (जो लाल प्रतिदीप्ति) पूर्व मौजूदा आईसीएस। मछली या तो 3 के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी गई थी – 5 दिन या तुरंत एक पूर्ण द्विपक्षीय गिल वितंत्रीभवन कराना पड़ा। 3 के बाद – वसूली के 5 दिनों के, जीबीमारियों काटा और immunohistochemistry के लिए तय कर रहे हैं। ऊतक तो एक α-5 प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग है (लक्ष्य कोशिकाओं से युक्त + / + K ATPase ना) सभी (दोनों नए और पहले से मौजूद) आईसीएस हरी लेबल है कि एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयोजन के रूप में। Confocal इमेजिंग का उपयोग करना, यह पूर्व मौजूदा आईसीएस और नए आईसीएस (एक व्यवहार्य mitochondrion-विशिष्ट डाई और α-5 दोनों के साथ लेबल) पीले रंग दिखाई देते हैं (α-5 ही साथ लेबल) हरी दिखाई देते हैं कि प्रदर्शन किया गया। मिलकर में इस्तेमाल किया दोनों तकनीकों मछली पर्यावरणीय चुनौतियों को उजागर कर रहे हैं जब गिल रेशा पर आईसीएस की स्फूर्तिदान, प्रसार और वितरण का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
आईसीएस मछली में आयनिक नियमन के लिए कार्यात्मक इकाई हैं और गिल तंतुओं की उपकला सतहों पर पाए जाते हैं और 4,6-8,10 lamellae। उपप्रकार की एक किस्म अनूठी विशेषताओं के अधिकारी है कि वर्णित किया गया है, आईसीएस के कई माइटोकॉन्ड्रिया के एक उच्च घनत्व (इस तरह वे भी mitochondrion युक्त कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है) और / या एंजाइम के एक बहुतायत की विशेषता है ना + / + K ATPase (NKA)। आमतौर पर, इन आईसीएस घर आयन विनियमन (जैसे, ना + / एच + एक्सचेंजर, ना + / CL – सह ट्रांसपोर्टर, एच + पंप) में शामिल अन्य पंपों, आयन चैनलों और एक्सचेंजर्स की एक किस्म 2,10,11। एक प्रतिपूरक तंत्र के रूप में आईसीएस के पुनर्वितरण और प्रसार विशेष रूप से आयनिक तनाव (जैसे, आयन-गरीब पानी के लिए जोखिम) 4,8,9 दौरान आयन homeostasis को बनाए रखने के लिए केंद्रीय है।
यह अध्ययन एक समय अंतर धुंधला तकनीक का वर्णनकुए एक मछली गहरे नाले में नव proliferated ionocytes (आईसीएस) की पहचान करने के लिए। इस तकनीक गिल मेहराब की एक पूरी द्विपक्षीय वितंत्रीभवन के साथ युग्मित है। सुनहरी (Carassius auratus), इन अध्ययनों में प्रयुक्त प्रजातियों, वे संरचनात्मक रूप से उनके गहरे नाले 2 फिर से तैयार करने के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता है क्योंकि गिल उपकला कोशिकाओं के प्रसार का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। ठंडे पानी (<15 डिग्री सेल्सियस) या हाइपोक्सिया क्रमश: तीन को आदत हैं – गिल remodeling (30 डिग्री सेल्सियस सामान्य रूप से 15 पर बनाए रखा) मछली जब एक interlamellar सेल द्रव्यमान का विकास या त्याग (ILCM) को दर्शाता है। सुनहरी पर समय अंतर धुंधला तकनीक का उपयोग कर पिछले अध्ययनों 4,5 remodeling गिल के संदर्भ में गिल पर आईसीएस के पुनर्वितरण, तंत्रिका वितरण और प्रसार पर ध्यान केंद्रित किया है। Katoh और Kaneko एक killifish में परिवर्तन और गिल आईसीएस के प्रतिस्थापन का अध्ययन करने के लिए इस उपन्यास तकनीक विकसित (Fundulus heteroclitus) transfeताजा पानी (परिवार कल्याण) के लिए समुद्र के पानी (दप) से rred। इस अध्ययन में, फोकस 25 डिग्री सेल्सियस को आदत सुनहरी में आईसीएस के प्रसार और तंत्रिका वितरण पर है।
गिल remodeling के संदर्भ में, यह दिखाया गया था कि समय अंतर धुंधला तकनीक का उपयोग करना, सुनहरी hypoxic जोखिम और बाद में normoxic वसूली के दौरान आईसीएस की एक निरंतर संख्या बनाए रखने के लिए, हालांकि, innervated कोशिकाओं का प्रतिशत normoxic वसूली की अवधि पाँच भर में कमी आई है। यह तंत्रिका नियंत्रण 12 के तहत अधिक से अधिक 70 साल पहले मछली में आयनिक तेज तंत्र हैं कि प्रस्तावित किया गया था। teleost गिल भी "गिल तंत्रिकाओं" 13,14 के रूप में भेजा चेहरे (सप्तम), जिह्वा-ग्रसनी (ग्यारहवीं) और वेगस (एक्स) तंत्रिकाओं द्वारा innervated है। Zebrafish पर Jonz और नर्स (2003) द्वारा स्टडीज (देनियो rerio) गिल स्फूर्तिदान स्फूर्तिदान की उत्पत्ति बाह्य (सेल शरीर के (तंत्रिका फाइबर की सेल शरीर गिल को बाह्य जाता है) के रूप में अच्छी तरह से आंतरिक पता चला है कितंत्रिका फाइबर) गिल के लिए स्वाभाविक है। एक ही लेखकों को भी गिल आईसीएस बाहर से 7 innervated रहे हैं कि प्रदर्शन किया।
इस अध्ययन में, पूर्ण द्विपक्षीय गिल वितंत्रीभवन के साथ युग्मित समय अंतर धुंधला तकनीक सुनहरी में बाह्य स्फूर्तिदान कमी आईसीएस के प्रसार की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया था। नाजुक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को सरल, और ionocytes आसानी से मानक इम्युनो-histochemical तकनीक का उपयोग कर पहचान कर रहे हैं – पूर्ण द्विपक्षीय गिल वितंत्रीभवन कपाल नसों नौवीं और एक्स उनके अपेक्षाकृत बड़े आकार (200 ग्राम 30 से) क्योंकि इन दो दृष्टिकोणों सुनहरी में संभव है विच्छेद करने के लिए संदर्भित करता है। विकास अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, विश्वविद्यालय, वर्तमान अध्ययन में, आईसीएस (जैसे, Mitotracker लाल) एक महत्वपूर्ण mitochondrion-विशिष्ट डाई या ना + / + K -ATPase (α-5 के α-सबयूनिट के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना कर रहे थे आयोवा, आयोवा सिटी आइए)। इस प्रोटोकॉल एक सीधा metho प्रदान करता हैvisualizing और मछली गिल पर आईसीएस के पुनर्वितरण और प्रसार का विश्लेषण करने के डी।
समय अंतर धुंधला तकनीक आयन तेज की गतिशील विनियमन को समझने के लिए और गिल epithelia में आईसीएस के अस्थायी पुनर्वितरण की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। एक सीधी प्रक्रिया हालांकि, समय अंतर धुंधला तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं कि महत्वपूर्ण बिंदुओं का एक नंबर रहे हैं। सुनहरी प्रोटोकॉल में आवंटित समय के लिए mitochondrion युक्त डाई से अवगत कराया जाना चाहिए। कम जोखिम mitochondrion युक्त कोशिकाओं (यानी, ionocytes) द्वारा डाई के गरीब तेज में परिणाम होगा। नियतन के दौरान गिल ऊतक जल्दी से excised किया जाना चाहिए और फोटो विरंजन से बचने के लिए अंधेरे में रखा। ऊतक निर्धारण के दो सप्ताह के भीतर इमेजिंग के लिए कार्रवाई की जानी चाहिए। द्विपक्षीय तंत्रिका सेक्शनिंग प्रक्रिया के दौरान मछली अच्छी तरह से anaesthetized है कि यह सुनिश्चित; नसों और रक्त वाहिकाओं को स्पष्ट रूप से पहचाने जाते हैं; यह एक वसूली की टंकी के लिए ले जाया जाता है और इससे पहले कि मछली पूर्ण opercular समारोह शुरू।
"> परिवार कल्याण पर्यावरण। निष्क्रिय आयन घाटा और आसमाटिक पानी लाभ 14 के बीच संतुलन साधने की दोहरी चुनौती के साथ मछली प्रस्तुत करता निष्क्रिय आयन घाटे के संतुलन filamental और तहदार epithelia जहां वे कर सकते हैं करने के लिए अनुवादित हैं जो आईसीएस भर नमक के सक्रिय तेज के माध्यम से होता है बाहरी वातावरण 2,4,8,9,16 के साथ सीधे संपर्क कर सकते हैं। हालांकि, गिल पर आईसीएस के स्थान स्थिर नहीं है। पिछले तीन दशकों में अध्ययन का एक नंबर है कि कई परिवार कल्याण मछली प्रजातियों से पता चला है, का सामना करना पड़ा जब एक ईओण और / या तापमान चुनौती के साथ, लामेल्ला 1,2,4,5,17-21 के अधिक डिस्टल क्षेत्रों के लिए लामेल्ला का रेशा या आधार से ब्रान्चियल आईसीएस पुनर्वितरित। इस तरह के पुनर्वितरण lamellae की मोटाई में वृद्धि हो सकती है, जो गैस हस्तांतरण समझौता कर सकते हैं (ओ 2, सीओ 2) 22। शोधकर्ताओं ने इस पांडुलिपि में वर्णित समय अंतर धुंधला तकनीक का इस्तेमाल किया है गिल epithelia भर में स्थानांतरण और emergenc ट्रैक करने के लिएइन विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों (चित्रा 1C) 1,4,5 के तहत गिल epithelia पर नए आईसीएस के ई।गहरे नाले, और शायद गिल आईसीएस, नौवीं और दसवीं कपाल नसों 7,23-25 द्वारा innervated रहे हैं। इन तंत्रिकाओं क्रमश: करने के लिए और गिल से अपवाही और अभिवाही आदानों दोनों ले। वे 4 वें गिल मेहराब के पीछे मुख गुहा के पृष्ठीय पक्ष पर स्थित हैं। नसों और द्विपक्षीय वितंत्रीभवन प्रक्रिया का प्रदर्शन किया जा सकता है जिस आसानी से की पहुंच प्रजातियों विशिष्ट है। नसों के ऊतकों की एक पतली परत के नीचे 4 वें गिल मेहराब के पीछे एक ही विमान में झूठ बोलने के लिए के लिए ट्राउट, उदाहरण के लिए, सिर की ओर इशारा किया और चपटा शरीर रचना की अनुमति देता है। इस नसों दिखाई और वितंत्रीभवन कार्यविधि को पूरा करने के लिए शोधकर्ता के लिए आसानी से सुलभ बना देता है। इसके विपरीत, सुनहरी एक छोटा थूथन और एक राउंडर सिर है। सुनहरी की नौवीं और दसवीं कपाल नसों पृष्ठीय एसआई में गहरी झूठविभिन्न विमानों के कब्जे में 4 वें गिल मेहराब के बाद गुहा के डी। इस उन्मुखीकरण नसों के लिए उपयोग की आसानी सीमा और उपयुक्त नसों की पहचान करने और तोड़ने के लिए एक और अधिक सावधान दृष्टिकोण की आवश्यकता है। वितंत्रीभवन प्रक्रिया का उद्देश्य क्रमश: करने के लिए और गिल से संवेदी अभिवाही और अपवाही इनपुट दूर करने के लिए है। गिल मेहराब की वितंत्रीभवन भी radioisotopes का उपयोग कर आयन प्रवाह प्रयोगों (जैसे, 22 ना) के साथ मिलकर किया जा सकता है। इन तकनीकों में गिल epithelia भर आयन आंदोलन पर नर्वस इनपुट के योगदान का अध्ययन करने के लिए मिलकर में इस्तेमाल किया जा सकता है। वितंत्रीभवन प्रक्रिया के लिए एक और सीमा तंत्रिका विच्छेद इस प्रकार, जब संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स के बीच अंतर यह तंत्रिका वितरण के दोनों प्रकार हटाया जा रहा है कि संभव है बंडल की अक्षमता है। किसी भी मोटर न्यूरॉन्स विच्छेद मछली के गिल और opercular आंदोलन को प्रभावित कर सकता है। गिल वितंत्रीभवन प्रयोगों प्रदर्शन जब इस प्रकार यह भी बाद वेंटिलेशन पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण हैमछली गैस और आयन एक्सचेंज दोनों के लिए पर्याप्त गिल आंदोलन है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रक्रिया से बरामद किया है।
अंधेरे चक्र और फेड वाणिज्यिक खाद्य छर्रों: इस पांडुलिपि उपयोग वयस्क पशुओं में वर्णित प्रोटोकॉल एक 12:12 प्रकाश पर रखा। इन तरीकों कई मायनों में संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, mitochondrion युक्त डाई प्रदर्शन के बाद वसूली की अवधि के शोधकर्ता प्रोटोकॉल (जैसे, 1, 3, 5, या 14 दिन) की आवश्यकताओं को समायोजित किया जा सकता है। प्रयोगशाला में mitochondrion युक्त डाई प्रदर्शन के बाद वसूली की सबसे लंबी अवधि 14 दिनों 4,5 किया गया है। वसूली के 14 दिनों के बाद mitochondrion युक्त डाई की प्रतिदीप्ति की तीव्रता में एक महत्वपूर्ण कमी नहीं था। दूसरा, α-5 प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग केवल NKA युक्त कोशिकाओं की पहचान करने और गिल आईसीएस के विभिन्न उपप्रकार के बीच भेद नहीं करता तक सीमित है। आईसीएस के बहुमत दोनों mitochondr हैं कि सौभाग्य से, सुनहरी में यह स्थापित किया गया थाआयन-रिच (Mitotracker साथ लेबल) और सभी मछली प्रजातियों 4,27 में मामला नहीं हो सकता है, जो कोशिकाओं (α-5 के साथ लेबल) NKA युक्त। भविष्य प्रयोगों चैनलों, पंप और एक्सचेंजर्स (जैसे, Nhe, एच + पंप) की एक किस्म के खिलाफ विशेष रूप से निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करके विशिष्ट आईसी उपप्रकार के अस्थायी पुनर्वितरण निम्नलिखित पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं। पिछले अध्ययनों में पाया गया कि mitochondrion युक्त डाई प्रदर्शनी NKA immunoreactivity 4 के साथ दाग ionocytes के बहुमत। आईसीएस की INNERVATION zebrafish व्युत्पन्न न्यूरॉन विशिष्ट प्रतिजन (Zn-12) के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। इस अध्ययन में,-5 α और Zn-12 प्राथमिक एंटीबॉडी दोनों के लिए एक ही माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा Fluor 488) का उपयोग कर पाया गया। दोनों को प्राथमिक एंटीबॉडी एक माउस की मेजबानी में उठाया जा रहा है और NKA युक्त कोशिकाओं और न्यूरॉन्स वे एक ही रंग प्रतिदीप्ति भले ही आकृति विज्ञान के प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि इस तथ्य से दूर है करने के लिए इस सीमा की वजह से है। अनुक्रमिक धुंधलाविभिन्न माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ (एलेक्सा Fluor 488 के साथ जैसे, पहले α-5 तब एलेक्सा Fluor 594 के साथ-12 Zn) भी एक ही रंग fluorescing दोनों मार्करों होने की समस्या को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्त में, पूर्ण द्विपक्षीय तंत्रिका सेक्शनिंग प्रोटोकॉल विशिष्ट गिल मेहराब के लिए तंत्रिकाओं को लक्षित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चयनात्मक तंत्रिका सेक्शनिंग धीरे गिल टोकरी (चित्रा 2B-ई) के पृष्ठीय अंत में पहली गिल मेहराब के लिए अग्रणी नसों को बेनकाब करने के लिए पहली और दूसरी गिल मेहराब को अलग करने से पहले गिल चाप पर प्रदर्शन किया जा सकता है। समय अंतर तकनीक को भी वे विकास और गिल को त्वचा से आयन परिवहन संक्रमण के रूप में लार्वा zebrafish मछली में ionocytes के वितरण का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |