전체 양자 간 길 탈 신경과 결합 시간 차등 염색 기술은 물고기에 Ionocytes을 연구하기 위해
Summary
This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.
Abstract
아가미 ionocytes (IC는) 물고기 이온 규제 기능 단위이다. 성인의 경우, 그들은 아가미 filamental와 라멜라 상피에서 발견되는 경우와 같은 나트륨 +, CL대로 전송 이온 – 이온 채널, 펌프 및 다양한 교환기를 통해 및 칼슘. 경골 아가미는 extrinsically, 설인 (IX)과 미주 (X) 신경 (VI) 얼굴에 의해 신경 지배된다. IX 및 X 신경도 아가미 IC의 신경 분포의 외부 소스입니다. 여기, 신경 분포, 확산 및 IC를 분포를 연구하는 데 두 가지 방법이 설명되어 있습니다 : 한 번에 차등 염색 기술과 전체 양자 간 아가미 탈 신경 기술. 간단히, 금붕어 중요한 미토콘드리아 특정 염료에 노출 (예를 들어, MitoTracker 레드) 레이블 (적색 형광) 기존의 집적 회로 (IC)가있다. 물고기는 중 3 복구 할 수 있었다 – 5 일 또는 즉시 전체 양자 간 아가미 탈 신경을 시행 하였다. 3 후 – 복구 5 일, g악 수확 및 면역 조직 화학이 고정되어 있습니다. 조직이 다음 α-5 일차 항체로 염색한다 (대상 세포를 포함하는 + / K + ATPase의 나) 모든 (신규 및 기존) IC를 그린 레이블 차 항체와 함께. 공 초점 영상을 사용하여, 그것은 기존의 IC를 새로운 IC를 (가능한 미토콘드리아 특정 염료와 α-5 모두 표시) 노란색 표시 (α-5 전용으로 표시) 녹색 나타나는 증명되었다. 직렬로 사용 두 기술은 물고기는 환경 적 도전에 노출되는 경우에 필라멘트 아가미 IC의 신경 분포, 확산 및 분포를 연구하기 위해 적용될 수있다.
Introduction
IC는 물고기 이온 규제 기능 단위이며, 아가미 필라멘트의 상피 표면에 발견하고 4,6-8,10를 얇은 판. 아형의 다양성이 독특한 특징을 갖고 그 설명 하였지만, IC는 많은 미토콘드리아의 높은 밀도 (따라서 또한 이들은 미토콘드리아 과다 세포들로 알려져있다) 및 / 또는 효소의 풍부한 특징 나트륨 + / K + ATP 아제 (NKA). 일반적으로 이러한 IC를 집 이온 규정 (예를 들어, 나 + / H + 교환기, 나 + / CL – 공동 수송, H + 펌프)에 관련된 다른 펌프, 이온 채널과 교환기의 다양한 2,10,11. 보상 메커니즘으로 IC의 재분배 및 확산은 특히 이온 성 스트레스 (예를 들면, 이온이 물 부족에 노출) 4,8,9 동안 이온 항상성을 유지하기위한 핵심이다.
이 연구는 시간 차동 염색 TECHNI 설명가야 1은 물고기 아가미에 새로 증식 ionocytes (ICS)를 식별합니다. 이 기술은 아가미 아치 완전한 탈 신경 양측에 연결되어있다. 금붕어 (붕어 속 auratus),이 연구에 사용 된 종은, 그들은 구조적으로 아가미 2 개조 할 수있는 놀라운 능력을 가지고 있기 때문에 아가미 상피 세포의 증식을 연구하기에 적합합니다. 차가운 물 (<15 ° C) 또는 저산소증, 각각 3 순응 – 길 리모델링 (30 ° C 일반적으로 15에서 유지) 물고기가 interlamellar 세포 질량의 성장 또는 후퇴 (ILCM)을 의미한다. 금붕어의 시간 미분 염색 기술을 사용하여 이전 연구 4,5- 리모델링 아가미의 맥락에서, IC의 아가미에 재분배, 신경 분포 및 확산에 초점을 맞추고있다. Katoh과 가네코 1 송사리의 변화와 아가미 IC를 교체를 연구하는이 새로운 기술을 개발 (Fundulus의 heteroclitus) transfe신선한 물 (FW)에 바다 물 (SW)에서 rred. 이 연구에서, 포커스는 25 ° C에 순응 금붕어 IC의 증식 및 신경 분포에있다.
아가미 리모델링의 맥락에서, 그것은 그 도시 된 시간 차분 염색 기술을 사용하여, 금붕어 저산소 노출 이후 정상 산소의 회복시, IC의 상수를 유지하지만, 분포하는 세포의 비율은 정상 산소의 회복 기간 (5)에 걸쳐 감소. 그것은 신경 제어 (12)에서 70 년 전 물고기 이온 흡수 메커니즘이라는 것을 제안했다. 경골 아가미는 "아가미 신경"13, 14라고 얼굴 (VII), 설인 (IX)과 미주 (X)에 의해 신경의 지배를한다. 제브라 피쉬에 Jonz 간호사 (2003)에 의한 연구 (다니오 레 리오 (rerio)) 아가미 신경 분포는 신경 분포의 기원은 외인성 (세포체 (신경 섬유의 세포체는 아가미 외적한다)뿐만 아니라 진성 인 것으로 나타났다신경 섬유)는 아가미의 본질이다. 같은 저자들은 아가미 IC를 extrinsically 7 분포하는 것을 보여 주었다.
본 연구에서는 전체 양측 아가미 탈 신경 결합 시간 미분 염색 기술은 금붕어 외인성 신경 분포 결여 IC의 증식을 조사 하였다. 섬세한 수술 절차를 간소화하고, ionocytes 쉽게 표준 면역 조직 화학적 기술을 사용하여 식별 – 전체 양자 간 아가미 탈 신경은 뇌신경의 IX와 X에 상대적으로 큰 크기 (200 g을 30에서) 때문에 이러한 두 가지 접근 방법이 금붕어 가능하다을 절단을 의미한다. 발달 연구 하이 브리 도마 은행, 대학 본 연구에서는 IC는 (예를 들어, MitoTracker 레드) 중요한 미토콘드리아 특정 염료 나 + / K + -ATPase (α-5의 α-서브 유닛에 대한 일차 항체를 사용하여 시각 하였다 아이오와, 아이오와시 IA). 이 프로토콜은 간단 운전 방식을 제공합니다시각화 및 물고기의 아가미에 IC의 재분배 및 확산을 분석 D.
Protocol
Representative Results
Discussion
시간 차분 염색 기술은 이온 흡수량의 동적 조절을 이해하고 아가미 상피에서 IC의 시간적 재분배를 검사 유용한 도구가 될 수있다. 비교적 간단하지만, 시간 차분 염색 기술의 성공에 매우 중요하다 요점들이있다. 금붕어는 프로토콜에 할당 된 시간의 미토콘드리아 풍부한 염료에 노출되어야합니다. 짧은 노출은 미토콘드리아 풍부한 세포 (즉, ionocytes)에 의한 염료의 가난한 흡수가 발생합니다. 정착 중에 아가미 조직을 절개해야 신속 및 포토 블리 칭을 방지하기 위해 어두운 유지. 조직을 고정 2 주 이내에 이미징 처리해야합니다. 양측 신경 절편을 수행하는 동안에는 물고기가 아니라 마취 있는지 확인; 신경과 혈관이 명확하게 식별됩니다 이 회수 탱크로 이동하기 전에 물고기가 가득 아가미 기능을 다시 시작합니다.
"> FW 환경. 수동적 인 이온 손실과 삼투 물 이득 (14) 균형의 이중 도전에 물고기를 제공 수동적 인 이온 손실의 균형 filamental 및 층상 상피 그들이 할 수있는 언어로 번역 IC를 가로 질러 소금의 활성 흡수를 통해 발생 외부 환경 2,4,8,9,16과 직접 접촉을합니다. 그러나, 아가미에 IC의 위치가 고정되지 않습니다. 지난 30 년 동안 많은 연구가 여러 FW 물고기 종을 보여 주었다 직면했을 때 이온 성 및 / 또는 온도 도전 과제 1,2,4,5,17-21 라멜라의보다 말단 영역에 라멜라의 필라멘트 또는 염기로부터 아가미 IC를 재분배. 이러한 재분배는 라멜라의 두께를 증가시킬 수있다 가스 이송 손상시킬 수있다 (O 2, CO 2, 22). 연구원이 원고에 기재된 타임 디퍼렌셜 염색 기술을 사용한 아가미 상피를 가로 질러 및 재배치에 의한 비상을 추적이러한 서로 다른 실험 조건 (그림 1C) 1,4,5에서 아가미 상피 세포에 새로운 IC는 전자.아가미, 그리고 아마도 아가미의 IC들은, IX 및 X 뇌신경 7,23-25에 의해 신경 지배를하고 있습니다. 이 신경은 각각과 아가미에서 원심성과 구 심성 입력을 모두 수행한다. 그들은 4 번째 아가미 아치 뒤에 구강의 등쪽에 위치한다. 신경 및 양자 탈 신경 절차가 수행 될 수있는 용이성 접근성은 특정 종이다. 신경 조직의 얇은 층 아래 4 번째 아치 길 뒤에 단일 평면 내에 놓여 송어, 예를 들어 헤드의 뾰족 평평 해부한다. 이렇게 신경이 가시 탈 신경 절차를 수행하는 연구자 쉽게 접근한다. 반면, 금붕어는 짧은 주둥이와 둥근 머리를 가지고있다. 금붕어의 IX와 X 뇌신경는 지느러미시에 깊은 거짓말다른 비행기를 차지하는 4 번째 아가미 아치 후 공동의 드. 이 배향은 신경의 접근 용이성을 제한하고 적절한 식별 및 신경 단절 더욱 신중한 접근법을 필요로한다. 탈 신경 절차의 목적은 각각과 아가미에서 원심성 및 구 심성 감각 입력을 제거하는 것이다. 아가미 아치 탈 신경은 방사성 동위 원소를 이용하여 이온 플럭스 실험 (예, 22 NA)과 연결될 수있다. 이러한 기술 아가미 상피 걸쳐 이온 이동에 신경 입력의 기여를 연구하는 직렬로 사용된다. 탈 신경 과정에 또 다른 제한은 신경을 절단하여 때, 감각과 운동 신경 세포 사이의 구별은 신경 분포의 두 가지 유형이 제거되는 것이 가능하다 번들 할 수 없다는 것입니다. 어떤 운동 신경을 절단하는 것은 물고기의 아가미와 아가미의 움직임에 영향을 미칠 수 있습니다. 탈 신경 아가미 실험을 수행 할 때 그러므로 그것은 또한 후에 환기를 모니터링하는 것이 중요물고기는 가스 및 이온 교환 모두를위한 충분한 아가미의 움직임이 있는지 확인하는 절차로부터 복구되었습니다.
어두운주기 및 공급 상용 식품 알약이 원고를 사용 성인 동물에 기술 된 프로토콜은 12시 12분 빛에 보관. 이러한 방법은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 먼저, 미토콘드리아가 풍부한 염료 노광 후의 회복 기간은 연구자의 프로토콜 (예를 들면, 1, 3, 5, 또는 14 일간)의 요건을 조정할 수있다. 실험실에서 미토콘드리아 풍부한 염료 노출 후 회복의 최장 기간은 14 일 4,5하고있다. 복구 14 일 후 미토콘드리아 풍부한 염료의 형광의 강도에 유의 한 감소가 없었다. 둘째, α-5 차 항체의 사용은 NKA 과다 세포를 식별하고 아가미 IC를 다른 서브 타입을 구별하지 않고 한정된다. IC의 대부분은 모두 mitochondr이라는 것을 다행스럽게도, 금붕어에 설립되었다이온이 풍부한 (MitoTracker 레이블) 및 모든 물고기 종 4,27의 경우하지 않을 수 있습니다 세포 (α-5 레이블) NKA 풍부한. 미래의 실험은 채널, 펌프 및 교환기 (예를 들어, NHE, H + 펌프)의 다양한에 대해 구체적으로 지시 된 항체를 사용하여 특정 IC 서브 타입의 시간 재배포 다음에 집중할 수 있습니다. 이전의 연구는 발견 미토콘드리아 풍부한 염료 전시 NKA 면역 4로 염색 ionocytes의 대부분. IC는 신경 분포 지브라 피쉬 유래 신경 세포 특이 적 항원 (Zn으로-12)에 대한 일차 항체를 사용하여 검출 할 수있다. 본 연구에서는 5-α 및 ZN-12 차 항체 모두에 동일한 이차 항체 (알렉사 형석 488)를 사용하여 검출 하였다. 양쪽 차 항체 마우스 숙주에서 제기되고 및 NKA 과다 세포 및 뉴런들이 동색 형광에도 형태학 구별 될 수 있다는 사실에 의해 극복되는이 제한 때문이다. 연속 염색다른 이차 항체 (알렉사 488와 형석 예, 제 α-5 다음 형석 알렉사 594로 ZN-12)도 동일한 색상을 모두 형광을 갖는 마커의 문제를 제거하는데 사용될 수있다. 마지막으로, 전체 양자 간 신경 절편 프로토콜은 특정 아가미 아치에 신경을 대상으로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 선택적 신경 절편 부드럽게 아가미 바구니 (도 2B-E)의 등쪽 단부에서 제 아가미 아치으로 이어지는 신경을 노출하기 위해 상기 제 1 및 제 2 아가미 아치를 분리하여 제 아가미 아치 상에 수행 될 수있다. 타임 디퍼렌셜 기술은 또한 개발하고 아가미 피부에 이온 수송로 전환 지브라 피쉬 물고기 유충 ionocytes의 분포를 연구하기 위해 적용될 수있다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
| α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
| zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
| Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
| Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
| Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
| Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Referências
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