Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel
Summary
TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.
Abstract
Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.
Introduction
Die Fähigkeit, menschliche Körperzellen in embryonale Stammzellen-ähnliche pluripotenten Stammzellen umprogrammieren (iPS) wurde zuerst von Takahashi et al entdeckt. 2007 1. Humane dermale Fibroblasten, die mit Retroviren exprimieren vier Transkriptionsfaktoren transduziert (die so genannt Yamanaka Faktoren Oct3 / 4, Sox2, c-Myc und Klf4) gezeigt wurden hoch ähnlich menschliche embryonale Stammzellen (hES) auf der Grundlage der Morphologie, Proliferation, Genexpression und epigenetische Zustand zu sein; entscheidend ist, sind ebenfalls iPSCs und zur Differenzierung zu Zellen von allen drei Keimschichten 1. Die Proliferationspotential und Differenzierung Kapazität von iPS-Zellen macht sie sehr attraktiv Werkzeuge; durch Umprogrammieren Zellen von Patienten mit bestimmten Krankheiten, iPSCs sowohl in vitro Krankheitsmodellsystemen und als potentielle Therapeutika verwendet werden.
Zu letzterem Zweck müssen mehrere Probleme, bevor das volle Potenzial von iPS-Zellen behandelt werdenin einer klinischen Umgebung realisiert werden kann; das tumorigene Potential von in vitro kultivierten hESCs und iPSCs, die Verwendung von xenogenen Derivate während Umprogrammierung und Zellerhaltung, und die Notwendigkeit der transplantierten Zellen in vivo zu verfolgen sind entscheidende Hürden für die klinische Anwendung von pluripotenten Stammzellen (Bewertet von Hentze et al. 2). Eine ideale Lösung für den Bedarf für die Verfolgung von differenzierten Zellen nach Transplantation würde eine visuell detektierbare Markierung, Resists Silencing und Buntheit unabhängig von der Anwendung. Robust und nachhaltig Ausdruck der integrierten Transgene ist am leichtesten erreichbar sind, wenn exogene DNA in die Safe-Harbour-Loci eingeführt; das heißt, Genomorte, die ausreicht, die Transkription eines integrierten Vektor zu ermöglichen, während gleichzeitig die Minderung Perturbationen Expression benachbarter Gene in 3. Ein solcher Ort, der sehr gut charakterisiert ist seit seiner Entdeckung ist das Adeno-assoziierte Virus integration Site 1 (AAVS1), in dem ersten Intron des Proteinphosphatase 1 regulatorischen Untereinheit 12C (PPP1R12C) -Gen. Dieser Locus wurde gezeigt, nicht nur aufrechterhalten und robuste Expression von integrierten Transgenen durch ausgedehnte Zeit in der Kultur und in vitro Differenzierung 3 zu ermöglichen, sondern auch zum Schutz der umgebenden Gene von Transkriptionsstörungs 4; Beide Funktionen werden angenommen, dass aufgrund der Anwesenheit von endogenen Chromatin Isolatorelemente flankieren den AAVS1 Website 5.
Fortschritte in der Genom-Engineering-Tools über nur den letzten zehn Jahren haben die Leichtigkeit und Effizienz, mit der genetischen Manipulationen in jedem Zelltyp erreicht werden erheblich erleichtert. Während frühe erfolgreiche Experimente angeführten überaus niedrige Niveaus von endogenen homologen Rekombination (HR) mit einer eingebrachten Geber für das Gen-Targeting in WSR 6,7 erreichen, wird die Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen, wie beispielsweise Zinkfinger-Nucleasen (ZFNs), daß signinifikant induzieren homologe Rekombination durch die Erzeugung einer doppelsträngigen DNA-Bruch hat den Wirkungsgrad solcher Experimente 8,9 stark erhöht. Die Umnutzung der beiden Transkriptionsaktivator ähnlichen Effektoren (Erzählungen) von pflanzenpathogenen Xanthomonas Gattungen und die prokaryotischen Cluster regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) / Cas9 System in effiziente ortsspezifische Designer-Nukleasen hat Gen-Targeting in pluripotente Stammzellen aus einem zugänglichen und praxisnahe Methodik 10-13.
Eine kürzlich durchgeführte Papier beschrieben, ein effizientes Verfahren für die stabile Integration eines grün fluoreszierenden Reporterkassette in die AAVS1 Safe-Harbour-Locus in menschlichen iPS-Zellen unter Verwendung von TALE Nukleasen (Talens) 14. Diese gezielten iPSCs behielten ihre Fluoreszenz selbst nachdem eine gerichtete Differenzierung zu Herzmuskelzellen und die Transplantation in einem Mausmodell für Myokardinfarkt (MI), ein starker Hinweis für die Nützlichkeit solcherstabil fluoreszierende pluripotenten Stammzellen 14. Gezielt Kolonien zu erhalten, wurde ein Gen-Trap-Verfahren verwendet, wobei ein Spleiß-Akzeptor (SA), plaziert 2A selbstspaltende Peptidsequenz, die das Puromycin-N-Acetyl-Transferase (PAC) Gen unter der Kontrolle des endogenen Promotors PPP1R12C; also nur iPS, die die DNA-Donor am AAVS1 Locus integriert haben äußern PAC, wodurch sie auswählbar auf Puromycin-Resistenz beruht; (Figur 1, 15). Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Erzeugung von AAVS1-GFP-iPS-Zellen berichtet in der jüngsten Papier 14, das den Prozess der Transfektion von iPS-Zellen mit Talens und ein 9,8 kb Spender, um ein 4,2 kb DNA-Fragment in die AAVS1 Safe-Harbour-Locus zu integrieren, die Auswahl iPS-Zellen auf Basis von Puromycin-Resistenz und Kommissionierung Kolonien klonalen Expansion. Die hierin beschriebenen Techniken können auf viele Genomtechnik-Experimente angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Erzeugung von AAVS1 Safe-Harbour gezielte menschlichen iPS-Zellen sind: (1) der effizienten Erbringung von TALEN und Donorplasmiden in iPS-Zellen durch Transfektion; (2) Optimierung der Dissoziation von iPS-Zellen in einzelne Zellen vor der Transfektion und Beschichtungs-Dichte nach der Transfektion; (3) Optimierung der Dosis und der Zeit der Medikamentenauswahl basierend auf dem Wachstum von iPSC Leitung; (4) sorgfältig seziert und Kommissionierung gezielte Kolonien und d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.
Materials
| NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS/DESCRIPTION |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL | Corning | 354230 | Store at -20°C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4°C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR – Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4°C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 | |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
Referências
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