Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft i USA med den viktigste årsaken til sykelighet og dødelighet er den svært tilbakevendende, kjemoresistent trekk ved denne sykdommen. Primær behandling består vanligvis maksimal cytoreduktiv kirurgi og påfølgende platinumbasert terapi, selv om det er noe som tyder på neoadjuvant terapi kan være nyttig i noen tilfeller en. Flertallet av pasienter responderer positivt på primærbehandling, men dessverre halvparten vil få tilbakefall innen 18 måneder 2.
De fleste ovarian maligniteter er epiteliale karsinomer og kan stamme fra overflaten epithelia av eggstokk eller eggleder 3,4. Flere studier støtter eksistensen av somatiske stamceller i det kvinnelige reproduksjonssystemet som formodentlig bistå i vevsreparasjon som er nødvendig etter eggløsning 5,6. Den høye proliferativ aktivitet på både eggstokk og eggleder under ovulasjon kan være en viktig faktor i utviklingen av kreft i eggstokkene (Gharwan, et al. manuskript innsendt). Avledning av tumordannende celler er uklart, men de kan oppstå fra normale stamceller, stamceller, eller differensierte celler gjennom mutasjoner som gjør dem i stand til å regulere divisjon eller skjebne. Disse cellene har også blitt betegnet som "cancer stamceller" eller "kreft-celler initierer", og kan vokse inn tumorigene, flercellede sfæroider ved lave festeforhold. Selv om den hierarkiske modellen av TIC utvikling kan være dynamisk, trenger tics deler mange av de samme funksjonene som normale stamceller inkludert quiescence, motstand mot kjemoterapi, langsiktig selvfornyelse og evne til å differensiere i ulike celle linjene 7,8.
Flere studier støtter eksistensen av tics i eggstokkreft og dagens innsats er underveis for å avklare mekanismen (e) som disse cellene støtte tumorigenesis 9-11. En rekke markører er blitt foreslått for å identifisere ovarian tics med forbedret tumorgenisitet inkludert CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, og MyD88, selv om den eksakte bidraget til hver markør er uklar, og kan være celletype spesifikk 11-16. Mens en universell markør eller et sett med markører ikke er entydig for eggstokkreft tics, har ulike grupper isolert eggstokkene tics oftere ved å velge for CD44 +, CD133 + og / eller celler med høy aldehyd dehydrogenase (ALDH) aktivitet 13,17-21. CD44 er et transmembran-glykoprotein som fungerer som en reseptor for hyaluronsyre og regulerer flere prosesser som er viktige for tumorprogresjon, inkludert adhesjon, proliferasjon, migrering, differensiering angiogenese og 22. CD133 er et trans glykoprotein hvis funksjon er fortsatt uklart, men studier tyder på det organiserer plasmamembran topologi 23. ALDH, et intracellulært enzym som katalyserer oksidasjonen av aldehyder, kan være den mest universal markør av tics som høy aktivitet har blitt identifisert i stamceller isolert fra en rekke vev og flere roller har blitt tilskrevet ALDH i å støtte normale stamceller og tics 24. Som nå, CD133 og ALDH1 synes å være de mest reproduserbare markører for eggstokkreft tics 13,21.
I tillegg til å forstå egenskapene til tics, er det også en stor innsats for å identifisere medikamenter som spesifikt retter denne undergruppe. Den høye tilbakefallsrate forbundet med eggstokkreft kan skyldes svikt i dagens chemotherapies å kunne utrydde tics. Selv om mesteparten av tumoren er mottagelig for eksisterende terapier, er tics antatt å være motstandsdyktige og i en tetthet upåviselig ved standardmetoder. Belyse mekanismer for terapiresistens og svulst tilbakefall er avgjørende for å bedre respons og samlet overlevelse av pasienter med eggstokkreft.
Her er kultur teknikker beskrevet thved berike for tics fra etablerte og primær eggstokkkreft cellelinjer. Dyrkningsforholdene beskrevet her har blitt brukt av flere grupper å indusere forplantning av tics eller sfæroide celler med stamcelle kvaliteter 11,12,14,16,20. Selv om det er flere stammecellekulturmedier og kosttilskudd som vanligvis anvendes for å anrike tics / sfæroider vi brukt et serumfritt medium formel med EGF og FGF, men uten tilsetning av B27 eller N-2 kosttilskudd. Disse supplementene, som vanligvis brukes for neuronal cellekultur og berikende for stamceller, har vist seg å fremme en mesenchymale fenotype 25,26, og det gjenstår en viss usikkerhet på området med hensyn til om tics som har en mesenchymale eller epiteliale fenotype er mer tumorigent 27-29 . For å minimere usikkerhet og variabler vi har valgt å bruke de vanligste formel, siden vi har å gjøre med epitelovarialcancer kreftceller.
Vedlikeholde celler i serum-frie medier i en lav vedlegg kolbeletter sfæroide dannelse og støtter formering av celler med CD133 ekspresjon og høy ALDH-aktivitet. Vårt arbeid har videre vist at celler som flyter under normale tilhenger forhold kan også representere en mer tumorigent TIC befolkningen. Injeksjon av celler dyrket under disse betingelser i atymiske nakne mus fører til høyere karsinogent potensial sammenlignet med celler dyrket i vedlagte betingelser i nærvær av serum. Mye informasjon angående rollen til tics i eggstokkreft initiering, progresjon, terapeutisk respons, og sykdoms tilbakefall kan oppnås ved bruk av disse teknikkene.
Protokollen er beskrevet her presenterer en effektiv og konsistent metode for berikende kulturer for celler med stamcelle funksjoner fra etablerte eggstokkreft cellelinjer og gjelder for pasientprøver primære. Denne metoden med hell beriker for tics tvers av en rekke cellelinjer. Det gjør det mulig for rettidig identifisering av forhold som beriker for en TIC og / eller tumorigent fenotype, uten å ta tid å fysisk sortere tics fra ikke-tics i befolkningen. På denne måte kan relative nivåer av ulike signalveier bli vurdert for deres bidrag til TIC fenotype ved å sammenligne tradisjonelle adherente kulturer til TIC kulturer ved hjelp av en rekke funksjonelle analyser. Hvis en ren TIC populasjon er ønskelig, kan isolering enkelt oppnås ved å inkorporere en fluorescens-assistert eller magnetisk sorteringstrinn i flowcytometri protokollen.
Det er viktig å huske på, men at uttrykket av TIC markørs, for eksempel CD133, CD44, eller ALDH, kan variere mellom cellelinjer eller pasientprøver selv av samme krefttype. For eksempel har vi funnet at de OVCAR-5-celler har høyere ekspresjon av CD44 i forhold til CD133, mens det omvendte er tilfelle for ACI-23. Det er derfor relevant å stole på tumorstart hos mus, og strømningscytometri-analyse som definitive av TIC tilstedeværelse. Etter denne protokollen, ble høy ALDH aktivitet konsekvent observert når eggstokkreft celler ble dyrket i stamcelle forhold. Interessant er CD133 uttrykk gående høyere i ACI-23 celler dyrket i tradisjonelle TIC kultur forhold, mens ALDH er høyest i floater TIC forhold. I motsetning til TGS-tre primære ascitesceller viser en liten økning i CD133 positivitet i henhold floater TIC forhold, men en bemerkelsesverdig økning i ALDH aktivitet i henhold til tradisjonelle TIC forhold. Disse funnene markere heterogenitet av eggstokkreft celler og plastisitet vanligvis forbindes med tics. For å støtte cla videreim at disse metodene forbedre tics, ble berikelse av TRA-1-60 positive celler også observert. TRA-1-60 er en pluripotency markør og har blitt brukt for å identifisere embryonal karsinom i ovariene og testikler samt prostatakreft TICS 30-32. Selv om våre metoder har vært vellykket med mange cellelinjer, er det mulig at standard TIC forhold kan være bedre egnet til noen eggstokkreft celler, mens de modifiserte floater forholdene bedre berike for tics i andre eggstokkreft cellepopulasjoner. Dette understreker igjen den forventede heterogenitet innenfor både pasient avledet og etablerte eggstokkkreft cellelinjer.
I tillegg til celleoverflatemarkører er det flere transkripsjonsfaktorer som har vist seg å karakter eggstokkreft tics inkludert Nanog, Sox2, Oct-4 11, selv om disse markørene er ikke spesifikke for eggstokkreft tics og heller representerer faktorer som er viktige for embryonal stamcelle pluripotency og differentiation 33,34. Vi undersøkte endringer i protein nivåer av disse faktorene og funnet ut at Nanog nivåene øker i TIC kultur forhold, i samråd med andre 13,35 samt CD133, TRA-1-60, og CD117. Et menneske stamcelle markør cDNA rekke viste videre en økning i CD133, Nanog, Melk, og PODXL genene i de klimatiske forhold i forhold til tradisjonelle tilhenger forhold. Viktigere, bør det bemerkes at, som med celleoverflate-markører, kan transkripsjons-faktorer assosiert med eggstokk tics varierer mellom cellelinjer og pasientprøver.
Vi har observert at cellene kan være mer tumorgene og uttrykke høyere nivåer av stamcellemerker hvis de er iboende ikke-klebende in vitro (dvs. flytende celler som ikke lett kan festes til en fastsittende plate). I kultur, cellelinjer som ACI-23 typisk ha mange levedyktige flytende celler og / eller celler som vokser vertikalt i en stablemote henhold tradisjonelle kultur conditioner. Selv vellykket berikelse av tics fra flytende celler og aggregater kan være gjeldende for relativt få cellelinjer inkludert de i denne studien og OVCAR-3 12, våre funn tyder på dette kan representere en mer tumorigent befolkning. Derfor, høsting av "flytende" populasjon av celler dyrket i standard vevskulturplater og medier kan tjene som en alternativ metode for anrikning TIC, for celler som tilpasser seg dårlig til kommersiell stamcelle medier.
Bruk av de ulike kultur metodene som presenteres i dette manuskriptet vil muliggjøre rask berikelse av TIC populasjoner og en bedre forståelse av hvilke faktorer støtte denne fenotype i forskjellige celler. Aktuelle anvendelser av denne fremgangsmåte er karakteriserende signalveier som er avgjørende for å støtte forplantningen av denne unike populasjon av celler. Resultatene fra disse studiene vil bidra til å avklare mekanismer for tumorprogresjon og tilbakefall.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |