In Utero iniezioni intra-cardiaca di pomodoro-lectine su embrioni di topo per valutare renale Blood Flow

Durante lo sviluppo embrionale, due processi vascolari discreti, ma simultanei avvengono: angiogenesi, il processo mediante il quale una nave cresce da un vaso, e vasculogenesi pre-esistente, che è una formazione de novo di navi da residenziali progenitori endoteliali ^1,2. Rispettivamente, il primo è sinonimo di flusso sanguigno, mentre il secondo è pensato avvenire sostanzialmente in assenza di esso.

Simultanea di formazione dei vasi sanguigni, un processo ciclico e dinamico della sintesi progenitrici delle cellule renali, la proliferazione e la differenziazione comincia a svolgersi il giorno embrionale 9.5 (E9.5). A questo punto la gemma ureterale (UB) invade dorsale in circostante mesenchima metanefrico (MM), e continua fino alla nascita ^3. Ripetuto ramificazione della UB in rapida condensazione metanefrico tappo mesenchima inizia la formazione delle unità funzionali del rene, nefrone. Con ogni nuova generazione di UB e nephron, le vecchie generazioni sono collocate in regioni corticali e midollari interni, dove poi subiscono ulteriore maturazione e differenziazione all'interno di ambienti prevalentemente vascolare-densi. Come evidenziato da Dressler et al. ^3, questo processo embrionale viene precipitato mediante segnalazione induttivo, come crosstalk tra UB e MM, e una miriade di fattori extracellulari ^3-6. Due fattori extracellulari recentemente esaminato entro il pancreas e reni in via di sviluppo includono tensione di ossigeno e il flusso di sangue ^7,8. Quest'ultimo sarà discusso in maggior dettaglio nel seguito con riferimento allo sviluppo del rene.

Per esporre il ruolo induttiva che il flusso di sangue potenzialmente gioca nella differenziazione delle cellule progenitrici nefrone, così come in altri processi organogenesi, metodi precise ed accurate di mappatura del flusso sanguigno embrionale è imperativo.

Metodi alternativi di misurazione del flusso sanguigno includono la prescrizione di ultrasound immagini e resina calchi ^9,10. Conclusivamente, queste modalità hanno dimostrato di essere intrinsecamente carente nella loro capacità di svelare contemporaneamente giustapposizioni temporali e spaziali tra il flusso di sangue e di differenziazione delle cellule staminali. Calchi in resina, per esempio, offrono un valido modello di patterning nave nei tessuti adulti, ma in vasi immaturi, come ad esempio con punti di tempo embrionali, le navi sono gravemente sottosviluppati e perde. Pertanto, la resina getta non riescono a tenere all'interno dei vasi piccoli, spesso porosi,.

Per questi ostacoli apparenti, tra gli altri, abbiamo scelto di integrare ecoguidata in vivo intra-cardiaca embrionale lectina pomodoro (TL) microiniezioni nelle nostre indagini di sviluppo del rene. In questa procedura utilizziamo una sonda ad ultrasuoni per guidare in modo sincrono una micropipetta ago montato riempita con 2,5 ml di soluzione TL nel ventricolo sinistro di embrioni di topo in punti E11.5, E13.5, E15.5 e E17.5 tempo. E17.5 È l'ultima età evolutiva come gli aghi non sono abbastanza forti per penetrare l'embrione più sviluppato.

I vantaggi di questo metodo sono abbondanti microiniezione. Microiniezione Ultrasound-guida permette il posizionamento preciso di un ago per iniezione nel ventricolo embrionale di sinistra, espulsione passiva e controllata della soluzione nel cuore pulsante dell'animale, il minimo danno al cuore e tessuti circostanti, e la prevenzione di improvvisa insufficienza cardiaca e morte embrione prima della perfusione tutto il corpo. Con l'uso di un TL FITC-marcato, qualsiasi vascolarizzazione perfuso manterrà il marker lungo il suo endoteliale membrana apicale. In combinazione con l'immunoistochimica, utilizzando pecam (CD31, Platelet endoteliale molecola di adesione delle cellule) e vari altri marker vascolari, siamo in grado di distinguere chiaramente tra navi perfuso e non-perfusione, nonché caratterizzare qualsiasi colorazione anomala dei tessuti circostanti.