Bereiding en karakterisering van SDF-1α-Chitosan-Dextransulfaat Nanodeeltjes
Summary
The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.
Abstract
Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.
Introduction
Dextran sulfaat (DS) en chitosan (CS) zijn polysachariden met meerdere gesubstitueerde negatief geladen sulfaatgroepen (DS) of positief geladen aminogroepen (gedeacetyleerd CS). Wanneer gemengd in een waterige oplossing de twee polysacchariden vormen polyelectrolytcomplexen elektrostatische interacties. De resulterende complexen kunnen grote aggregaten die worden fase gescheiden van de waterige oplossing (neerslag) of kleine deeltjes die in water dispergeerbaar (colloïden) vormen. De specifieke voorwaarden die bijdragen aan deze uitkomsten zijn uitgebreid bestudeerd, en zijn samengevat en geïllustreerd in detail in een recente beoordeling 1. Onder deze omstandigheden zijn de tegengesteld geladen polymeren moeten 1) significant verschillend molecuulgewicht twee basisvereisten voor het produceren water dispergeerbare deeltjes; en 2) worden gemengd in een niet-stoichiometrische verhouding. Deze voorwaarden zullen de kosten-neutrale gecomplexeerd polymere segmenten gegenereerd door lading toestaanneutralisatie te scheiden en vormen de kern van het deeltje, en de overmaat polymeer aan de buitenmantel 1 vormen. De glycan deeltjes beschreven in dit protocol zijn bedoeld voor pulmonale levering, en zijn ontworpen netto te zijn negatief geladen, en van nanometer afmetingen. De negatieve oppervlakte lading vermindert de kans op cellulaire opname van de deeltjes 2,3. Deeltjes van nanometer dimensie van de doorgang door het distale luchtwegen. Om dit doel te bereiken, de hoeveelheid DS in dit preparaat dan CS (gewichtsverhouding 3: 1); en hoog molecuulgewicht DS (gewichtsgemiddelde MW 500.000) en lage molecuulgewicht CS (MW 50-190 kDa, 75-85% gedeacetyleerd) gebruikt.
SDF-1α is een stamcel homing factor, die de homing-functie via haar chemotactische activiteit uitoefent. SDF-1α speelt een belangrijke rol bij homing en onderhoud van hematopoietische stamcellen in het beenmerg, en rekrutering van progeNitor cellen naar de perifere weefsels voor letsel reparatie 4,5. SDF-1α een heparine-bindingsplaats in de eiwitsequentie, waardoor het eiwit bindt aan heparine / heparansulfaat, vorm dimeren, worden beschermd tegen protease (CD26 / DPPIV) inactivering en interactie met doelcellen via celoppervlak receptoren 6-8. DS soortgelijke structuureigenschappen als heparine / heparansulfaat; dus de binding van SDF-1α DS zou vergelijkbaar met die van de natuurlijke polymere liganden.
In de onderstaande voorschriften beschrijven we de bereiding van SDF-1α-DS-CS nanodeeltjes. De procedures vormen één van de formuleringen die eerder zijn onderzocht 9. Het protocol is oorspronkelijk aangepast van een onderzoek van VEGF-DS-CS nanodeeltjes 10. Een kleinschalige bereiding wordt beschreven, die gemakkelijk kan worden opgeschaald met dezelfde voorraad oplossingen en voorbereiding voorwaarden. Na bereiding worden de deeltjes gekarakteriseerd by behandeling van hun grootte, zeta potentieel, omvang van SDF-1α oprichting, in vitro release tijd, en de activiteit van de opgenomen SDF-1α.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals hierboven vermeld, worden de DS-CS nanodeeltjes gevormd door ladingsneutralisatie tussen polyanion (DS) en polykation (CS) moleculen. Omdat de lading interactie optreedt gemakkelijk tijdens de moleculaire botsing, de concentratie van de polymeeroplossingen en de roersnelheid tijdens mengen kritisch voor de grootte van de resulterende deeltjes. Een algemene trend is dat meer verdund DS en CS oplossingen 15 en hogere roersnelheid resultaat in kleinere deeltjes.
De formulering …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies: HL671795, HL048743 en HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | |
| Syringe filter, PES membrane 0.22 um. | Millipore | SLGP033RS |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | |
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
Referências
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
