הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים
Summary
Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.
Abstract
The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.
Introduction
אפיתל ריח העכבר בחלל האף כולל 6-10,000,000 עצב סנסורי חוש הריח דו קוטבי 1. כל נוירון חוש הריח בוחר אחד של 1,200 גני קולט odorant לביטוי. איתור של odorants מתחיל בodorant מחייב קולטני ריח 2, אשר לאחר מכן מפעיל cyclase adenylyl סוג III (ACIII) 3 דרך חלבון G הספציפי Gα חוש הריח olf 4. העלייה וכתוצאה מכך monophosphate המחזורית אדנוזין (cAMP) פותחת מחזורי (CNG), ערוץ קטיון לא סלקטיבי שהוביל לזרם של Ca 2 + וNa +, ולאחר מכן Ca מגודרת נוקלאוטיד 2 + זרם מוביל לפתיחת Cl Ca 2 + מופעל – ערוץ 5,6. וכתוצאה מכך כלפי חוץ Cl – השטף הוא הקל על ידי Cl תאיים גבוה – ריכוז מתוחזק על ידי Cl היציב – ספיגה, סביר להניח באמצעות Na + / K + / Cl – NKCC1 cotransporter,Cl – / HCO3 – SLC4A1 מחליף, ומובילים עדיין להיות מזוהים אולי נוספים 6-8.
יש נוירונים חוש הריח דו קוטביים אקסונים בודדים, unbranched שמקרינים ישירות לנורת חוש הריח, ודנדריט שמשתרע על פני השטח של האפיתל ומסתיים כתא מיוחד, הידית דנדריטים. מהכפתור הזה, 10-30 cilia, שיכול להגיע לאורך של עד 50-60 מיקרומטר, נובע לריר המכסה את פני השטח האפיתל 9. חלבונים של המפל הולך אותות הקנונים הם מקומיים בעיקר בקרום של cilia אלה. המשטח החושי המוגבר של האפיתל מגביר את היכולת לזהות odorants. עקב הצפיפות של עצב סנסורי, cilia המשתרע מידיות דנדריטים שכנות להתערבב. כך מצויים בתערובת אקראית של cilia מתאי עצב שונה, המבטאים סוגים שונים של קולטני ריח, על פני השטח של האפיתל. האיתור והתאהקצאת רגילה של חלבוני הריסים אשר נמצאים רק בתת-קבוצה של תאי עצב תחושתיים היא קשה ולכן בcryosections. בנוסף, האיתור המדויק של חלבונים כגון לאורך הריסים הוא בקושי אפשרי, שכן cryosections הוא בדרך כלל דק יותר מהאורך הממוצע של cilia.
כדי לאפשר חקירה של לוקליזציה הריסים של חלבונים בממברנה עד כה uncharacterized בתאי עצב הרחה, אנו מותאמים pt טכניקת הכנת פנים המאפשרת ניתוח מפורט של לוקליזציה חלבון בcilia. בקצרה, העכבר הוא הקריב והראש לפצל ליד קו האמצע. Turbinates, האף, ועצמות חזיתיות יוסרו כדי לחשוף את המחיצה. המחיצה עם חלק חוש הריח של האפיתל הבטנה הוא התיר על ידי חיתוך כל החיבורים לחלל האף. לאחר לשים את המחיצה לתוך צלחת פטרי מלא בפתרון של רינגר, האפיתל הוא קילף und הועבר לשקופיות זכוכית מצופים. בעקבות fixat קצרצעד יון, ניתן לבצע נהלי immunostaining אם הטיפול הוא עדין ככל האפשר, כדי למנוע נזק של רקמת הרירית. אנחנו מדגימים את הרזולוציה השגה על ידי השוואת ההכתמה של שני חלבוני קרום שונים בcilia חוש הריח בcryosections הקלאסי ובen הפנים ההכנה תיארה.
Protocol
Representative Results
Discussion
The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
Referências
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P. Ultrastructural aspects of olfactory signaling. Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
