マウスの主嗅覚系における繊毛のホールマウントのラベリング
Summary
Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.
Abstract
The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.
Introduction
鼻腔内マウス嗅上皮は6から10000000バイポーラ嗅細胞1を備える。各嗅覚ニューロンは表現のために1200嗅覚受容体遺伝子のいずれかを選択します。臭気物質の検出は、その後4 OLF嗅覚特定のGタンパク質Gαを経由してアデニリルシクラーゼIII型（ACIII）3を活性化する嗅覚受容体2、に結合すること、付臭剤によって開始されます。環状アデノシン一リン酸（cAMP）の結果として生じる上昇は、環状ヌクレオチド依存性（CNG）のCa 2+およびNa +の流入につながる非選択性陽イオンチャネルを開き、続いてのCa 2+流入は、Ca 2+活性化Cl -の開口部につながる–チャネル5,6。外側へのCl結果–フラックスは高い細胞内のClによって促進される–のNa + / K + / CL経由そう取り込み、 – –共輸送体NKCC1、濃度が安定したのClによって維持のCl – / HCO3 –交換SLC4A1、そしておそらく追加のまだ同定されるトランスポーター6-8。
バイポーラ嗅覚ニューロンは嗅球に直接投影する単一の非分枝の軸索を有し、そして上皮の表面まで延びており、特殊なコンパートメント、樹状ノブとして終了デンドライト。このノブから、最大で50〜60程度の長さに到達することができ10-30繊毛は、上皮表面9を覆っている粘液に発する。カノニカルシグナル伝達カスケードのタンパク質は、主にこれらの繊毛の膜に局在している。上皮の増加感覚表面が臭気物質を検出する能力を増幅する。起因する感覚ニューロンの密度に、近隣の樹状ノブから延びる繊毛が混在。この、別のニューロンからの繊毛のランダムな混合をもたらす交絡上皮の表面上の嗅覚受容体の異なるタイプを発現する。検出とセル感覚ニューロンのサブセットにおいてのみ存在する毛様タンパク質のウラル割り当てが凍結切片では困難である。凍結切片は、通常、繊毛の長さの平均よりも薄いので、また、繊毛に沿ってこのようなタンパク質の正確な局在化は、かろうじて可能です。
嗅覚ニューロンにおけるこれまでの特徴付けされていない膜タンパク質の毛様体の局在の調査を可能にするために、我々は繊毛におけるタンパク質の局在の詳細な分析を可能にする専用顔調製技術を最適化した。簡単に言えば、マウスを犠牲にし、頭が正中線付近で分割されます。鼻甲介、鼻、および前頭骨が中隔を露出するために除去される。ライニング上皮の嗅覚部分とセプタムは、鼻腔にすべての接続を切断することによって緩められる。リンゲル液で満たされたペトリ皿にセプタムを入れた後、上皮は、コーティングされたガラススライドに移しウントを剥離する。短いfixatに続いて取り扱いが脆弱な組織の損傷を避けるために、できるだけ穏やかであればイオンステップは、免疫染色の手順を行うことができる。我々は、古典的な凍結切片にし、説明エンフェイス調製における嗅覚繊毛2つの異なる膜タンパク質の染色を比較することによって達成可能な解像度を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
Referências
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