Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.
ここでは、ザリガニ腹部神経索の解剖を実証する。準備は最後の2胸部神経節(T4、T5)と腹部神経節(A6にA1)の鎖を含む。 swimmeretシステム:神経節のこのチェーンは、腹肢(swimmerets)の協調運動を駆動し、中枢神経系(CNS)の一部を含む。これは、ザリガニの各swimmeretがリズミカルな交互作用1-3を生成し、独自の独立したパターン生成カーネルによって駆動され、5 20年以上前から知られている。運動ニューロンは、2つの解剖学的および機能的に異なる集団4を含み、各swimmeretの筋肉組織を支配する。一つはswimmeretの後退(パワーストローク、PS)を担当しています。他のswimmeretの延長(戻り行程、RS)を駆動する。 swimmeretシステムの運動ニューロンは、生体内で記録されたパターンと同一である、自然に仮想運動パターンを生成することができる</全角> 1。
このレポートの目的は、学生の実践的な実験室のコースに独立した微細回路のネットワークとの連携を生成するリズムを研究するための興味深いと便利なモデルシステムを導入することである。提供されたプロトコルは、神経節をdesheathingと孤立神経系から細胞外にswimmerets架空の運動パターンを記録し、神経節の孤立したチェーンのピン止め、ザリガニの腹部神経索の解剖のためのステップバイステップの手順が含まれています。
さらに、当社は、樹状突起から細胞内に記録されたswimmeretニューロンの活動を監視することができます。ここでは、また簡単にこれらの技術を説明し、いくつかの例を提供する。さらに、swimmeretニューロンの形態は、様々な染色技術を用いて評価することができる。ここでは、染料いっぱいニューロンとswimmeret運動ニューロンのプールのバックフィル(イオントフォレーシスによる)細胞内の例を提供する。私たちの研究室では、我々は、この準備仮想運動の基本的な機能を研究するために、CNSの活性に対する感覚フィードバックの効果、および細胞レベルで微細回路間の調整を使用しています。
ザリガニのswimmerets姿勢制御に機能を果たすと動物が前方に泳ぐときリズミカルに打つ、彼らの巣穴やメスが卵5、6の通気換気。シグナルザリガニのswimmerets、Pacifastacusのleniusculusは 、1/5に第二のペアで起こる腹部7の両側に1つずつ手足と腹部のセグメント、。中枢神経系は、無傷動物ならびに単離された神経索の調製においてswimmeret運動を駆動する独自のリズミカルな運動パターに生成する。全く感覚フィードバックまたは降順入力が存在しない場合に生成リズミカルな運動パターンは、仮想移動1、2と呼ばれている。swimmeretシステムでは、この運動パターンが無傷動物で測定されたswimmeretsの活動からの任意のパラメータが異なっていません。
各swimmeretの移動はに位置し、1℃に制限されているマイクロ回路によって駆動され、hemiganglion 1 orresponding – 。3に各マイクロ回路では5同定された非スパイクニューロンを含み、カーネルを生成するパターンがあります。機能的にはパワーストローク(IPS)の阻害剤又は戻りストロークのインヒビター(IRS)8のいずれかとして特徴付けることができる。これらのIPSとIRSの介在ニューロンは、交互の活動が相互抑制9によって駆動され、むしろ、内因性の発振器ではありません。これらのニューロンは、直接swimmeret運動ニューロンを阻害するので、交 互のPS-RSの動きは10が生成される。ロコモーションしかし、活動の生成を必要とするだけでなく、別の独立したマイクロ回路の協調んばかり。 swimmeretシステムでは、このような調整は手足が正しい時間にアクティブであることを確実に配位マイクロ回路によって確立される。このマイクロ回路は、各セグメント11-15で3識別さニューロンによって構築されています。
このプロトコルは、目を提供eは、初めてステップバイステップ解剖ガイドは神経節(A6にT4、 図1)の鎖を分離する。私たちは、孤立した腹部神経索とdesheathe各神経節をピンする方法を示しています。この単離された神経系の調製においては、swimmeret運動に関与する神経細胞は、電気生理学的および形態学的実験に使用するための準備ができている。このプロトコルの第2の部分は、swimmeret運動パターンの主な特徴を示しています。これはswimmeret運動ニューロンの活動を記録するために細胞外にステップバイステップガイドが含まれています。 RSの運動ニューロンの軸索は、PS運動ニューロンの軸索は、同じ神経の後枝を通して( 図1)プロジェクトながら、神経N1の前方支店を通じてプロジェクト4。したがって、それらの活性は、差動ピン電極と、これらの枝から記録することができる。
<br/> 図1:腹部神経節6(A6)とそれ T4 の模式図に胸部神経節4(T4)から単離し神経系:胸部神経節4。 T5:胸部神経節5。 A1、A2、… A6腹部神経節1、腹部神経節2 …腹部神経節6。 N1:神経N1。 N2:神経N2。 N3:神経N3。 PS:パワーストローク。 RS:リターンストローク。方向性略語: =前部。 P =後部。
この解剖手順および実証電気生理学的手法は、学部学生のための便利であり、生理中の学生実用的コースを補完することがあります。神経節の孤立したチェーンは、神経系の機能、調整、またはswimmeretマイクロ回路6の変調など運動16、17で適応行動の神経細胞の制御を研究するために多数の実験で使用されてきた。ザリガニswimmeretシステムは、このように膨大な量を提供しています面白い授業またはTのすべてのザリガニと仮想運動パターンの細胞外記録の腹側神経索の解剖で始まる機会を雨。
ザリガニの解剖学とその腹部神経節を前に5、18、19、20に記載されている、それは重要な神経の切断を回避するために、解剖前にそれらに慣れることをお勧めします。
それは、単離された神経索の劣化を防止するために、23℃未満の温度で調製しておくことが重要である。これは、すべての20-30分を冷ザリガニ生理食塩水を浴溶液で置換することによって容易?…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、図のいくつかと助けるためヨスBurgertに感謝。私たちは、インゴSelbach(とグループ「Edelkrebsprojekt NRW」)は、実験動物と実験室を供給するために彼の努力のために感謝しています。私たちは、原稿の最初のバージョンの校正のためのアンナC.シュナイダーに感謝。この研究は、エミー·ネーターDFGグラントSM 206 / 3-1と女性教員のためのケルン大学のスタートアップ助成金によってサポートされていました。
Name of Material/ Equipment | Tipo | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
4-channel extracellular amplifier: MA 102 | Amplifier | Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany | for extracellular recording | |
air-table | Technical Manufacturing Corporation (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA |
63-534 | for intracellular recording | |
Axon Digidata 1440A | Digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA | DD1440A | digitizes recorded signals |
big bucket | filled with ice | |||
Clampex & Clampfit | pClamp 10, recording and analysis software | Molecular Devices Design, Union City, CA | pClamps 10 Standard | for extracellular recording |
cold lamp source | with flexible light guide (fiber optic bundle) | Euromex microscopes holland, Arnhem, BD | LE.5211 & LE.5235 | |
computer and monitor | equipped with recording software | for extracellular recording | ||
container and pipette for liquid waste | ||||
crayfish saline | contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. | always keep at temperatures ~ 4° C | ||
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) | fluorescent dye, lysine fixable | Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | D3328 | for intracellular dyefill of neurons |
differential pin electrodes | made from stainless steel ɸ 0.2 mm | for extracellular recording | ||
dissection dish | (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone | used in the gross disection | ||
faraday cage | for extracellular recording | |||
fixing pins | for pinning the specimen | |||
forceps (biology, Dumont #5) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11252-20 | fine forceps: used to pick nerves |
forceps (biology, Dumont #55) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11255-20 | extra fine forceps: used for desheathing |
forceps (electronic, Dumont #5) | Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11251-20 | coarse forceps: used to grab specimen and pins |
intracellular electrode | Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament | Sutter Instruments, Novato, CA | BF100-50-10 | for intracellular recording and dyefill of neurons |
Leica S8 Apo StereoZoom | Dissection Microscope Zoom 1x – 8x | Leica, Germany | 10446298 | for extracellular recording |
microscope table | for extracellular recording | |||
mirror | to illuminate preparation from below | for extracellular recording | ||
modeling clay | for extracellular recording | |||
Olympus SZ61 | Dissection Microscope Zoom 0.67x – 4.5x | Olympus, Germany | for the dissection | |
petri dish | 94 x 16 mm; lined with clear silicone | Greiner bio-one, Germany | 633180 | used to pin the isolated chain of ganglia |
ring scissors | ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 14054-13 | for gross dissection (steps 2.1 – 2.11) |
saline dispenser with a 16 gauge needle (outer ɸ 1.6mm) attached via a flexible tube. | Volume ~ 60ml, | used for exsanguination | ||
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors | cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 15024-10 or 15000-08 | for desheathing |
stainless steel wire ɸ 0.125 mm | to cut pins of 4-7 mm length | Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany | for pinning of the nerve cord | |
student Vannas spring scissors or alternative: Moria Spring Scissors | cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 91500-09 or 15396-00 | for gross and fine disection (steps 2.11 – 3.14) |
sylgard | 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon | Dow Corning, Midland, MI, USA | ||
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip | for extracellular recording |