श्रवण तंत्रिका की optogenetic उत्तेजना
Summary
कर्णावत प्रत्यारोपण (सीआईएस) श्रवण तंत्रिका के प्रत्यक्ष बिजली की उत्तेजना से सुनवाई सकें. हालांकि, गरीब आवृत्ति और तीव्रता संकल्प सीआईएस के साथ सुनवाई की गुणवत्ता की सीमा. यहाँ हम श्रवण अनुसंधान और भविष्य सीआईएस के विकास के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में चूहों में श्रवण तंत्रिका की optogenetic उत्तेजना का वर्णन.
Abstract
कर्णावत प्रत्यारोपण (सीआईएस) द्वारा सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स (SGNs) की सीधी बिजली की उत्तेजना प्रत्यारोपित बहरा विषयों 1 6 के बहुमत में खुला भाषण समझ में सक्षम बनाता है. बहरहाल, वर्तमान सीआईएस के साथ ध्वनि कोडिंग के कारण कोक्लीअ 7 9 की tonotopic अक्ष के साथ SGNs की एक बड़ी संख्या को सक्रिय प्रत्येक इलेक्ट्रोड संपर्क में आने से व्यापक वर्तमान प्रसार के लिए गरीब आवृत्ति और तीव्रता संकल्प किया है. ऑप्टिकल उत्तेजना स्थानिक अधिक इसलिए, SGNs की सक्रियता ही सीमित है और वादा किया है कि बिजली की उत्तेजना, कोडिंग के उच्च आवृत्ति संकल्प के लिए एक विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है. हाल के वर्षों में, कोक्लीअ के प्रत्यक्ष अवरक्त रोशनी श्रवण तंत्रिका 10 में प्रतिक्रियाओं का आह्वान किया गया है. बिजली की उत्तेजना 10,11 और अनिश्चितता अंतर्निहित तंत्र से 12 के रूप में बनी हुई है की तुलना में फिर भी यह अधिक ऊर्जा की आवश्यकता है. यहाँ हम SGNs को प्रोत्साहित करने के लिए optogenetics पर आधारित एक विधि का वर्णनchannelrhodopsin 2 (ChR2) 13 या ChR2 संस्करण पकड़ने 14 के वायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति की न्यूरोनल अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कम तीव्रता नीले प्रकाश के साथ. हम एक छोटे से कृत्रिम उद्घाटन (cochleostomy) या दौर खिड़की के माध्यम से ChR2 व्यक्त SGNs को प्रोत्साहित करने के लिए डायोड (μLEDs) और फाइबर युग्मित पराबैंगनीकिरण उत्सर्जन सूक्ष्म प्रकाश का इस्तेमाल किया. हम प्रकाश पैदा की क्षमता (optogenetic श्रवण brainstem प्रतिक्रिया: oABR) की खोपड़ी रिकॉर्डिंग से प्रतिक्रियाओं assayed या श्रवण मार्ग से microelectrode रिकॉर्डिंग से और ध्वनिक और बिजली की उत्तेजना के साथ उन्हें तुलना.
Introduction
विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, 360 मिलियन लोग दुनिया भर में सुनवाई हानि से ग्रस्त हैं. बहरा विषयों में, सीआईएस द्वारा SGNs के प्रत्यक्ष बिजली की उत्तेजना उन्हें 1,2,4,5 के बहुमत में खुला भाषण समझ सकें. हालांकि सीआईएस इसलिए सबसे सफल neuroprosthesis जा रहा है, 200,000 से अधिक लोगों में प्रत्यारोपित किया गया है, वर्तमान कर्णावत प्रत्यारोपण द्वारा संचालित ध्वनि एन्कोडिंग सीमित है. सीआईएस हर एक श्रवण तंत्रिका इस प्रकार कोक्लीअ में Corti के बेकार संवेदी अंग को दरकिनार की एक tonotopic क्षेत्र सक्रिय हो जाता है, जहां इलेक्ट्रोड की एक निश्चित संख्या से बिजली की उत्तेजना के आधार पर कर रहे हैं. सामान्य सुनवाई श्रोताओं हालांकि आज के सीआईएस केवल 12-22 आवृत्ति चैनल 4 के लिए उपयोग, 2,000 से अधिक आवृत्तियों भेदभाव कर सकते हैं. इस वजह से कई अलग अलग ध्वनि आवृत्तियों 8,15 का प्रतिनिधित्व करते हैं कि SGNs की एक बड़ी संख्या को सक्रिय प्रत्येक उत्तेजक इलेक्ट्रोड 7,9, से बड़े पैमाने पर वर्तमान प्रवाह करने के लिए है. इससीमा बहुध्रुवीय उत्तेजना का इस्तेमाल, लेकिन उच्च शक्ति की खपत 16,17 की कीमत पर सुधार किया जा सकता है. ध्वनि तीव्रता के लिए अपने उत्पादन में गतिशील रेंज भी आम तौर पर 6-20 डीबी 4,18 नीचे, सीमित है. इन कारणों के लिए, सुधार आवृत्ति और तीव्रता संकल्प शोर के वातावरण, छंदशास्र बूझ और संगीत की धारणा में भाषण मान्यता उन्नति सीआई प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण उद्देश्य हैं.
श्रवण तंत्रिका को उत्तेजित करने के लिए एक अलग विकल्प ऑप्टिकल उत्तेजना है. लाइट सुविधा, बेहतर स्थानिक कारावास का वादा आवृत्ति संकल्प बढ़ रही है और यह भी एक बेहतर तीव्रता संकल्प, जिसके परिणामस्वरूप गतिशील रेंज को चौड़ा करने, एक छोटा सा एसजीएन आबादी को लक्षित करने के लिए ध्यान केंद्रित किया जा सकता है. दरअसल, अवरक्त प्रकाश के साथ कर्णावत उत्तेजना पशु मॉडल 10,11,19 में उत्कृष्ट आवृत्ति संकल्प दिखाया है. उत्तेजना के इस तरह का एक नुकसान यह बिजली की उत्तेजना की तुलना में अधिक ऊर्जा की आवश्यकता है <sup> 10,11. इसके अलावा, सीधे श्रवण न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित करने के लिए विधि की क्षमता के बारे में चिंताओं 12,20 उठाया गया है.
अवरक्त उत्तेजना के लिए एक विकल्प के रूप में, हम SGNs प्रकाश के प्रति संवेदनशील रेंडर करने optogenetics रोजगार. Optogenetics गैर invasively के लिए आनुवंशिक और ऑप्टिकल तकनीक को जोड़ती है और विशेष रूप से उच्च अस्थायी परिशुद्धता (समीक्षा 21 23) के साथ कोशिकाओं को नियंत्रित कि एक उपन्यास दृष्टिकोण है. वर्तमान में सबसे अक्सर इस्तेमाल साधन Chlamydomonas reinhardtii की माइक्रोबियल channelrhodopsin 2 (ChR2) जीन की अभिव्यक्ति को रोजगार और एक प्रकाश gated कटियन चैनल 24 एन्कोडिंग, उसके वेरिएंट. ChR2, न्यूरॉन्स में transduced और नीले प्रकाश से सक्रिय करते हैं, इस प्रकार की कोशिकाओं को 24 से 27 depolarizing, गैर चयनात्मक कटियन चैनल में कार्य करता है कि एक 7 transmembrane हेलिक्स प्रोटीन है. ChR2 अच्छी तरह से बताया गया है 24,28- 31 और कई वेरिएंट Actio संशोधित करने के लिए विकसित किया गया हैn स्पेक्ट्रम, gating और पारगम्यता गुण 32,33. हमारे काम का उद्देश्य श्रवण मार्ग के सक्रियण के लिए कर्णावत optogenetics स्थापित करना है. हम श्रवण तंत्रिका को उत्तेजित करने के लिए optogenetic दृष्टिकोण channelrhodopsin की अभिव्यक्ति के लिए सर्पिल नाड़ीग्रन्थि की आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है कि ध्यान दें. चूहों और चूहों के साथ काम करना tonotopic अक्ष के साथ और जानवरों 36 के पार थोड़ा परिवर्तनशीलता के साथ channelrhodopsin की अभिव्यक्ति प्रदान जो उपलब्ध ट्रांसजेनिक जानवरों 13,34,35, के उपयोग की अनुमति देता है. उचित Cre लाइनों के साथ सशर्त alleles 37 का मेल सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए प्रदान करता है. अन्य जानवरों की सर्पिल नाड़ीग्रन्थि में जीन स्थानांतरण ऐसे optogenetics 38 में एक मानक दृष्टिकोण है कि एडिनो से जुड़े वायरस के रूप में और हम चूहों 36 में अच्छी तरह से काम करने के लिए पता चला है कि वायरस के उपयोग की आवश्यकता है. आनुवंशिक हेरफेर और इस तरह immu के रूप में प्रतिकूल प्रभाव के लिए विदेशी प्रोटीन भालू जोखिम एन्कोडिंग transgenes की अभिव्यक्तिपूर्वोत्तर प्रतिक्रियाओं और / या प्रसार, समझौता हालत या आनुवंशिक रूप से चालाकी से कोशिकाओं की भी मौत. इस प्रदर्शन के प्रयोजन के लिए हम ऑप्टिकली श्रवण मार्ग को प्रोत्साहित करने के लिए तेरा -1 प्रमोटर 13 के तहत सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करें. हम SGNs 39 में संस्करण पकड़ने 14 के वायरस की मध्यस्थता हस्तांतरण का उपयोग कर के रूप में प्रदर्शन अन्य channelrhodopsin वेरिएंट में एक ही उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दें.
कर्णावत optogenetics आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है, यह अनुकूलित एसजीएन उत्तेजना के लिए आणविक ट्यूनिंग प्रदान करता है और बिजली की उत्तेजना की तुलना में जब वादे आवृत्ति और तीव्रता संकल्प सुधार हुआ. श्रवण मार्ग के optogenetic उत्तेजना अनुसंधान सुनवाई के लिए प्रासंगिक है. उदाहरण के लिए, यह ध्वनि localizat में वर्णक्रमीय एकीकरण के लिए आवश्यकता के विश्लेषण में, विकास के दौरान tonotopy की गतिविधि पर निर्भर शोधन की पढ़ाई के क्षेत्र में प्रगति का वादा कियाआयन और केंद्रीय श्रवण प्रणाली में आवृत्ति विशिष्ट अभिवाही अनुमानों के बीच बातचीत की हद तक की.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रयोगों SGNs की optogenetic उत्तेजना का प्रदर्शन, और, सिद्धांत रूप में, यह भी आंतरिक और / या बाहरी बालों की कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, opsins की अभिव्यक्ति प्रदान की. इन प्रयोगों …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एजुकेशन एंड रिसर्च (Neurotechnology के लिए बर्नस्टीन फोकस टी मोजर करने, 01GQ0810 अनुदान, और मेड ईएल जर्मनी) के जर्मन संघीय मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था; एन Strenzke और टी मोजर जर्मन रिसर्च नेनो माइक्रोस्कोपी और मस्तिष्क की आण्विक फिजियोलॉजी के लिए केंद्र के माध्यम से फाउंडेशन (FZT 103, टी मोजर) और SFB889 के माध्यम से,).
Materials
| Urethane | Sigma Aldrich | U2500-100G | Anesthetic |
| Xylazine HCl | RXV | Sedative and analgesic | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser | Analgesic | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Only to be used to hold soft tissue |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | To open the skin and help with the muscle dissection |
| Lempert Rongeurs | Fine Science Tools | 16004-16 | They are very useful to easily remove the bone from the bulla |
| 473-nm laser | Changchun New Industries | MLL-III473 | 100 mW solid state 473 nm laser |
| Laser driver | Changchun New Industries | DPSSL MLL 100 mW | TTL operated laser driver |
| 250 µm optical fiber | Any comercial ; e.g. Thorlabs | M42L05 | |
| Acousto-optical modulator | Crystal Technology, Inc. | PCAOM VIS | Control the amount of light coupled into the fiber from the laser |
| Controller for Acousto-optical modulator | Crystal Technology, Inc. | 160T1-8SAR-24-0.8 | Control the acousto-optic modulator |
| Solo2 laser power & energy meter | Gentec-EO | Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser | |
| Blue µLED | Cree | C470UT200 | It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough |
| TDT System | Tucker-Davis Technologies | RZ6-A-P1 | It can be used any system for stimulus generation presentation and data acquisition |
| Single-shank, 16-channel silicon probe | Neuronexus | a1x16-5mm-100-177-CM16LP | These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use |
| Omnidrill | World Precision Instruments | 503598 | Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation |
| Micro Drill Steel Burrs | any commercial; e.g. Fine Science Tools | 19007-07 | |
| Self tapping bone screw | any commercial; e.g. Fine Science Tools | 19010-10 | Reference screw |
| Micromanipulator | any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis | Positioning of recording probe |
Referências
- Rubinstein, J. T. Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development. Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).
- Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. Cochlear implants: the view from the brain. Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).
- Clark, G. M. The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).
- Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. Cochlear implants: system design, integration, and evaluation. IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future. Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).
- Moore, D. R., Shannon, R. V. Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain. Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).
- Shannon, R. V. Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction. Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).
- Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor. Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).
- Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents. Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).
- Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli. Journal of biomedical. 12 (2), 021008 (2007).
- Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements. Journal of neural engineering. 8 (5), 056006 (2011).
- Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser. IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).
- Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).
- Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
- Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants. The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).
- Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L). The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).
- Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context. Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).
- Zeng, F. G., et al. Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).
- Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking. Journal of biomedical. 16 (11), 118002 (2011).
- Verma, R., Guex, A. A., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hearing research. 310, 69-75 (2014).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Hegemann, P., Nagel, G. From channelrhodopsins to optogenetics. EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).
- Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels. Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function. Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).
- Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).
- Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle. Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).
- Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).
- Hegemann, P., Möglich, A. Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools. Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).
- Mattis, J., Tye, K. M., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).
- Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Tomita, H., Sugano, E., et al. Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter. PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. Ultrafast optogenetic control. Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).
- Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).
