Summary

Выделение и культуры диссоциированных сенсорные нейроны От куриные эмбрионы

Published: September 24, 2014
doi:

Summary

Модели клеточной культуры обеспечивают детальный контроль над условиями окружающей среды и таким образом предоставляют мощную платформу для выяснения многочисленные аспекты нейронов клеточной биологии. Мы описываем быстрый, недорогой и надежный способ, чтобы изолировать, диссоциации и культуры сенсорных нейронов от куриных эмбрионов. Подробная информация о подготовке субстратов и иммуноцитохимии также предоставляются.

Abstract

Нейроны являются многогранные клетки, которые несут информацию, необходимую для выполнения различных функций, включая ощущения, движения двигателя, обучения и памяти. Изучение нейронов в естественных условиях может быть сложной задачей в связи с их сложностью, их многообразной и динамичной среде, и технических ограничений. По этим причинам, изучая нейроны в пробирке может оказаться полезным, чтобы разгадать сложные загадки нейронов. Четко определены характер моделей клеточных культур обеспечивает детальный контроль над условиями окружающей среды и переменных. Здесь мы опишем, как изолировать, отделить, и культура первичные нейроны от куриных эмбрионов. Этот метод является быстрым, недорогим, и генерирует энергично растет сенсорных нейронов. Процедура последовательно производит культур, которые высоко обогащенные для нейронов и имеет очень мало, не нервных клеток (менее 5%). Первичные нейроны не хорошо прилипать к необработанной стекла или культуры ткани пластика, поэтому подробные процедуры для создания двух DistinКТ, четко определенные ламинином содержащих субстраты для нейронов обшивки описаны. Искусственный нейроны являются весьма поддаются нескольких клеточных и молекулярных методов, в том числе со-иммунопреципитацией, живой воображения клеток, РНК-интерференции, и иммуноцитохимии. Процедуры двойного иммуноцитохимии на этих культивируемых нейронов были оптимизированы и описано здесь.

Introduction

Нейроны являются сложными клетки, которые несут информацию, необходимую для выполнения различных функций, включая ощущения, зрение, движения двигателя, обучения и памяти. Уникальная от других типов клеток, нейронов расширить рук, как процессы, называемые аксоны, чтобы сформировать основные нервные дороги для связи. Во время развития специализируется отсеков, расположенных на кончиках растущих аксонов, называется конусы роста, перемещаться по концерта внеклеточных сигналов, чтобы привести аксон к ее соответствующему назначению. Сложные молекулярные механизмы, лежащие в основе роста конус навигацию, полностью не поняты. Чтобы лучше понять эти механизмы, исследователи использовали модели клеточной культуры для изучения нейронов в определенной и упрощенной в пробирке среды. Изучение нейронов в культуре 1 привело к значительному прогрессу в нашем понимании нейронов клеточной биологии, включая: дифференцировки нейронов 2, цитоскелета динамики, эндоцитоза и торговли, дендритоврегулирование 3,4, регенерацию аксонов 5, и клинические состояния, такие как невропатии 6. Кроме того, культивируемые нейроны являются весьма пригодны для широкого спектра методов исследования, включая иммуноцитохимии, клеточной поверхности ко-иммунопреципитации, Вестерн-блоттинга, трансфекции, RNAi, и живого изображения, такие как TimeLapse анализа конуса роста подвижности. Таким образом, культивирование первичных нейронов является мощным подход к выяснению многочисленные аспекты клеточной биологии нейронов.

Модель культуры клеток обеспечивает следователям подробного контроля над условиями окружающей среды и переменных. Например, субстрат, на котором нейроны покрытием (и расти на) можно легко манипулировать. Здесь мы предоставляем подробные инструкции для генерации две различные субстраты, один с низкой концентрацией ламинином-1, а другой с насыщающих концентраций ламинином-1. Удивительно, различные концентрации и той же молекулы может иметь драматические последствияот внутреннего состояния нейронов, а также их клеточной поверхности композиции. Например, внутриклеточные уровни цАМФ и поверхностных уровнях интегринов значительно отличаются в нейронах посеянных на этих двух субстратов 7,8. Дополнительные исследования показали, что другие молекулы, в том числе фибронектина и хондроитинсульфата протеогликаны, воздействия на экспрессию молекул клеточной поверхности и нейронов моторики 7-11. Кроме того, растворимые молекулы, такие как нейротропинов и neurotropins также влияют на состав клеточной мембраны нейронов и моторику 12-16 и может быть легко и точно управлять в модели культуры клеток.

Здесь мы опишем методы, чтобы изолировать и культуры диссоциированных сенсорные нейроны от куриных эмбрионов. Эта процедура была использована, чтобы сделать значительные прорывы в области нейробиологии, в том числе аксонов 5,7,8,10,11,16-21 и был изменен с процедурой для изоляции ганглиозных клеток 22. Естьнесколько преимуществ такого подхода. Во-первых, многие черты цыплят спинномозговых ганглиев (DRG) развития хорошо охарактеризованы в том числе сроков рождения, расширение аксона, и экспрессия белка анкеты 2,23-28, обеспечивая тем самым поучительный основу, на которой строится информативным в пробирке эксперименты. Во-вторых, диссоциированных нейронов культуры позволяют исследователю более непосредственно изучать нейронов по сравнению с альтернативными подходами с использованием интактных DRG эксплантов (которые содержат нейроны и не-нейрональных клеток) и / или смешанных культур, содержащие оба диссоциированных нейронов и не-нейрональных клетках. В-третьих, процедура, описанная здесь проста, недорогой и поддаются студентов. Таким образом, эта методика может быть использована для исследований, а также в учебных целях. Кроме того, незначительные вариации этого протокола должны предоставлять очистку быстро, с высоким выходом нейронов от других, чем ДРГ источников. Например, эта процедура может быть изменен, чтобы обеспечить нейронально ENRiched культуры из других тканей, таких как эмбрионального переднего мозга или спинного мозга.

Протоколы Иммуноцитохимическая были оптимизированы для этих диссоциированных нейронов культур и подробно описаны здесь. Процедура двойного иммуноцитохимии против нейронной молекулы клеточной адгезии (NCAM) и β1 интегринов предоставляется. Данные, полученные от этих иммуноцитохимических методы были использованы для изучения пространственной кучность и интенсивность нескольких молекул в культивируемых нейронов 8,16.

Protocol

1 Покровные Приготовление: Acid Wash и Выпекайте По крайней мере, за 2 дня до вскрытия (шаг 2), начать следующие шаги по подготовке покровные. Выполните кислоты шаг раствором, чтобы удалить масла и тщательно мойте покровные. Загрузка покровные в держателе фарфора, что вертикально п?…

Representative Results

Протокол, описанный здесь позволяет следователям культуры обогащенный население диссоциированных эмбриональных сенсорных нейронов с очень немногих (например, <5%) не-нервных клеток 7,8,10,16. Многочисленные DRGs могут быть получены из пояснично-крестцового отдела, грудного и ше…

Discussion

Здесь мы представляем подробные протоколы для выделения и культивирования диссоциирован сенсорные нейроны от куриного эмбриона. Эта процедура создает обогащенный население энергично растущих нейронов в пробирке 7,8,10,16. Многочисленные клеточные и молекулярные методы могу?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Элисон Филбрук, Belinda Barbagallo и Майкл Фрэнсис для проницательных комментариев к этой статье. В исследовании, опубликованном в этой публикации была поддержана премии R15 ЗОНА 1R15NS070172-01A1 присуждена МРОТ.

Materials

sterile small culture dishes (35mm) Corning 430165
sterile large culture dishes (100mm) Falcon 353003
sterile large petri dishes (100mm) VWR 89000-302
glass petri dish (100mm) VWR D108962 
fine forceps Fine Science Tools 11251-10 
standard forceps Fine Science Tools 1100-12
coverslips  (22×22) Fisher 12 518 105K 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder Thomas scientific 8542E40
Fetal Bovine serum Gibco 17502-048 use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media 
HCL VWR VW3204-1 use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl Sigma S9888 use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1 Invitrogen 23017-015 Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube cell treat 229411
PBS CMF 10X Gibco 14200 used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X Gibco 14080 used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12 Lonza 12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 10438 use in F12HS20 at 10%
HEPES Sigma H3375 make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin Sigma P0781 use 5mls in 500mls of F12 media
NT3 Millipore GF031 Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer 
N2 Invitrogen 17502048  aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF RnD systems 256-GF Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media 
l-glutamine Sigma G7513 aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin Sigma T4049 aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose Sigma S9378 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) 
Triton-X 100 Sigma T-8787
Paraformaldehyde Sigma P6148 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) 
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
normal goat serum Life technologies PCN500
microscope slides VWR 16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM Millipore AB5032 polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin Millipore MAB19294 monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Life technologies A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 Life technologies A11036

Referências

  1. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
  2. Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
  3. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
  4. Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
  5. Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
  6. Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
  7. Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
  8. Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
  9. Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
  10. Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
  11. Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
  12. Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
  13. Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
  14. Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
  15. Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
  16. Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
  17. Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
  18. Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
  19. Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
  20. Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
  21. Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
  22. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  23. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
  24. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
  25. Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
  26. Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
  27. Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
  28. Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
  29. Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
  30. Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
  31. Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
  32. Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
  33. Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
  34. Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
  35. Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).

Play Video

Citar este artigo
Powell, S., Vinod, A., Lemons, M. L. Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos. J. Vis. Exp. (91), e51991, doi:10.3791/51991 (2014).

View Video