Summary

Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos

Published: October 15, 2014
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Summary

Una preparación rápida sedimento bacteriano de un cultivo de sangre positivo puede ser utilizado como una muestra para aplicaciones tales como la identificación por MALDI-TOF, la tinción de Gram, la prueba de susceptibilidad a los antibióticos y prueba basada en PCR. Los resultados pueden ser comunicados rápidamente a los médicos a mejorar el resultado de pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo.

Abstract

Infecciones del torrente sanguíneo y sepsis son una causa importante de morbilidad y mortalidad. El resultado exitoso de los pacientes que sufren de bacteremia depende de una rápida identificación del agente infeccioso para guiar el tratamiento antibiótico óptimo. El análisis de la tinción de Gram de hemocultivo positivo puede llevar a cabo con rapidez y ya afecta significativamente el régimen de antibióticos. Sin embargo, todavía se requiere la identificación precisa del agente infeccioso para establecer el tratamiento óptimo de destino. Se presenta aquí una preparación sedimento bacteriano simple y rápido de un cultivo de sangre positivo que puede ser utilizado como una muestra para varias aplicaciones posteriores esenciales tales como la identificación por MALDI-TOF MS, las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) por ensayo de difusión en disco o sistemas automatizados de AST y por PCR automatizado basado en pruebas de diagnóstico. El rendimiento de estos diferentes sistemas de identificación y AST aplicados directamente sobre los sedimentos bacterianos de cultivo de sangre es muy SIMilar con el rendimiento que se obtiene normalmente a partir de colonias aisladas cultivadas en placas de agar. En comparación con los métodos convencionales, la rápida adquisición de un sedimento bacteriano se reduce significativamente el tiempo para reportar tanto la identificación y AST. Así, siguiendo la positividad del cultivo de sangre, identificación por MALDI-TOF puede ser reportado en menos de 1 hora mientras que los resultados de AST por sistemas automatizados AST o ensayos de difusión en disco dentro de 8 a 18 horas, respectivamente. Del mismo modo, los resultados de un ensayo rápido basado en la PCR se pueden comunicar a los médicos a menos de 2 horas tras el informe de una bacteriemia. Juntos, estos resultados demuestran que la rápida preparación de un sedimento bacteriano cultivo de sangre tiene un impacto significativo en el tiempo de identificación y de respuesta AST y por tanto en el resultado exitoso de pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo.

Introduction

Infecciones del torrente sanguíneo y la sepsis en pacientes hospitalizados son una causa importante de morbilidad y mortalidad. Por lo tanto, se observa la mortalidad relacionada con infecciones del torrente sanguíneo en aproximadamente 14% a 37% de los pacientes hospitalizados y puede aumentar hasta el 35% en las unidades de cuidados intensivos de los pacientes 1-3. La identificación rápida del agente infeccioso es fundamental para orientar el tratamiento antimicrobiano óptimo y para aumentar el éxito de la terapia antimicrobiana 4,5. El rápido análisis de la tinción de Gram de hemocultivo positivo ya tiene un impacto significativo en la adaptación de la terapia antimicrobiana 6,7 pero la identificación precisa del agente infeccioso que se requiere para proporcionar el tratamiento antibiótico más adecuado a las pacientes. Por ejemplo, diferentes regímenes de tratamiento con antibióticos tienen que ser aplicadas tras bacteriemia con enterococos y estreptococos que son difíciles de distinguir por la tinción de Gram. Del mismo modo, la identificación de las especies LevEL es necesario para detectar enterobacterias Gram negativo que codifica un gen cromosómico ampC que confieren una mayor resistencia a β-lactámicos 8.

Con un hemocultivo positivo, el enfoque de diagnóstico convencional es subcultura del agente infeccioso en diferentes placas de agar, que requiere varias horas de incubación adicional previa identificación con diversos enfoques, incluyendo pruebas bioquímicas, el crecimiento en diferentes medios selectivos y sistemas de identificación microbiana automatizados. El tiempo de los resultados de un enfoque de diagnóstico convencional es de aproximadamente 1 a 3 días.

La aparición de la tecnología de desorción láser asistida por matriz / espectrometría de masas de tiempo de vuelo-ionización (MALDI-TOF) para la identificación rápida de microorganismos ha proporcionado una nueva herramienta para identificar rápidamente los microorganismos de colonias crecidas en placas de agar sino también directamente a partir de sangre positivo culturas (Figura 1) 9-12. The uso de MALDI-TOF para identificar un agente infeccioso a partir de cultivos de sangre se ha reducido significativamente el tiempo a los resultados a unos pocos minutos en lugar de las horas y los días requeridos por los métodos tradicionales. Como se discutió por Croxatto et al. 13, la eficiencia de identificación MALDI-TOF se basa en diferentes parámetros, incluyendo la pureza y la cantidad de microorganismo. Estos dos criterios se obtienen fácilmente a partir de colonias discretas cultivadas en placas de agar, pero requiere un tratamiento de pre-analítica para el enriquecimiento bacteriana y purificación a partir de muestras complejas, tales como cultivo de sangre, que contienen múltiples componentes celulares y proteínas que pueden interferir con la identificación MALDI-TOF.

Varios métodos de aislamiento de microorganismos a partir de cultivo de sangre se han utilizado en una serie de estudios que incluyen saponina u otro método detergentes suaves para la extracción bacteriana 9,14, el método de separador de suero 10, la lisis métodos de centrifugación 12 </sarriba> y soluciones comercialmente, tales como el kit de sepsityper. Nuestro laboratorio de diagnóstico bacteriológico ha desarrollado una preparación sedimento bacteriano sencilla hemocultivo a base de cloruro de amonio-lisis de los eritrocitos, que permiten la identificación rápida de bacterias y levaduras por MALDI-TOF y los sistemas de identificación automáticos (Figura 2) 15. Esta preparación de pellets de hemocultivo también proporcionar una muestra para otras aplicaciones posteriores directos tales como la tinción de Gram, pruebas de diagnóstico basados ​​en PCR automatizados, como el POCT-PCR para la detección rápida de la meticilina-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos con sistemas automatizados de AST y / o por ensayos de difusión de disco en placas de agar (Figura 3).

En este trabajo se describen los diferentes pasos para la preparación del sedimento bacteriano hemocultivos según ha explicado Prod'hom et al. 15 (Figura 4). También vamos a desescriba los protocolos para tres de las principales aplicaciones que se pueden realizar en el sedimento de la cultura de la sangre: La identificación por MALDI-TOF 15, la identificación (ID) y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) con los sistemas automatizados 16 para enterobacterias y estafilococos y PCR automatizada prueba de diagnóstico basado en la detección de MRSA 17.

Protocol

Este protocolo ha sido desarrollado y validado después de los procesos de investigación y desarrollo y las normas éticas de nuestra institución antes de ser implementado como una herramienta rutinaria. 1 Preparación de un cultivo de sangre bacteriana Pellet por Amonio Procedimiento Cloruro de eritrocitos-lisis Preparación de una cultura positiva de sangre para su posterior centrifugación. Esterilizar la tapa hemocultivo. Añadir 70% de etanol en la tapa de la botel…

Representative Results

En el estudio realizado por Prod'hom et al. 15, sedimentos bacterianos obtenidos por cloruro de amonio lisis centrifugación de 122 hemocultivo positivo de 78 pacientes se analizaron por MALDI-TOF MS. Fuera de 122 hemocultivos positivos, 95 (77,9%) fueron correctamente identificados a nivel de especie y uno (0,8%) a nivel de género. Los 26 (21,3%) Bolitas de hemocultivo restantes no dieron ninguna identificación fiable por MALDI-TOF. Entre ellos, 21 eran bacterias gram positivas incluyendo 13 e…

Discussion

En comparación con los métodos de diagnóstico de hemocultivos positivos convencionales, la rápida adquisición de un sedimento bacteriano utilizando el cloruro de enfoque centrifugación lisis de amonio a reducir el tiempo para informar de identificación en un 16 a 24 horas y el tiempo de reportar AST por 24 a 48 horas (Figuras 1 y 3).

Rápida introducción de la terapia antibiótica adecuada es fundamental para mejorar el pronóstico de los pacientes que sufren de infe…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a los técnicos del laboratorio de Bacteriología del Centro Hospitalario Universitario de Lausana por su ayuda para poner en práctica las técnicas en el laboratorio.

Materials

20 needle gauge  Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target  steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

Referências

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Citar este artigo
Croxatto, A., Prod’hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

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