Aiguë de dissociation de la lamproie réticulo axones pour permettre l'enregistrement de la sortie de visage membrane des terminaux présynaptiques fonctionnels individuels

La transmission synaptique est un processus extrêmement rapide et précise. Action éventuelle invasion de la terminaison présynaptique conduit à l'ouverture de VGCCs situés dans la membrane de presse du visage, l'augmentation résultante présynaptique Ca2 ⁺ agissant comme déclencheur pour la fusion des vésicules et la libération de neurotransmetteurs ^1. Toutes ces étapes se produisent dans des centaines de microsecondes ^2, et donc nécessitent un couplage spatial serré de VGCCs à la fusion des vésicules machines ^3. Présynaptiques flux de ^{Ca2 +} ont été caractérisées principalement par imagerie approches utilisant des colorants sensibles ^{4 de} Ca. L'incorporation de ^{Ca2 +} tampons qui modulent Ca2 ⁺ dans les neurones présynaptiques a été utilisée pour caractériser la relation entre indirectement calcium présynaptique et la neurotransmission ^3. En outre, la modulation de la concentration de Ca2 ⁺ libre présynaptique par uncaging Ca2 ^{+ 5} ou enregistrement macroscopic courants de ^{Ca2 +} ont été utilisés en conjonction avec les mesures de fusion et / ou la libération des vésicules; telles que les mesures de capacité ⁶ ou post-synaptiques réponses ² pour répondre à la même question. Cependant, la caractérisation de ^{Ca2 +} courants directement à la face de sortie, la section spécialisée de la membrane présynaptique où dépolarisation de la membrane est traduit en ^{Ca2 +} courants de déclenchement fusion des vésicules synaptiques et la libération de neurotransmetteurs, fait partie intégrante de l'obtention d'une mesure précise de la Ca2 ⁺ exigence de fusion des vésicules synaptiques. En outre, la capacité à caractériser directement Ca2 ⁺ courants à terminaisons présynaptiques individuels, couplé permet avec des mesures simultanées précises de la fusion des vésicules et la libération d'une explication précise de la relation de synchronisation entre l'évolution dans le temps du potentiel d'action, présynaptique ^Ca2 courant, la fusion des vésicules et la libération. L'accès à la membrane de presse de visagen'est pas disponible dans la plupart des terminaisons présynaptiques en raison de fermer l'apposition par les dendrites post-synaptiques. Cette inaccessibilité a été un obstacle majeur dans la caractérisation des VGCCs car elle empêche des mesures directes de courant dans les terminaux présynaptiques individuels. La caractérisation directe de présynaptiques Ca2 ⁺ courants dans les terminaux présynaptiques individuels a donc pas été possible dans les synapses centrales et n'a été atteint que dans deux terminaux présynaptiques de type calyceal; calice de type synaptique des poussin ganglion ciliaire ^7-10 et rat calices ^11,12. Dans tous les autres terminaux présynaptiques dont la synapse réticulo géant dans la lamproie moelle épinière ^13, le manque d'accès à la membrane libération présynaptique visage a nécessité l'utilisation d'approches indirectes telles que Ca ^de l'imagerie pour étudier présynaptiques flux de ^{Ca2 +.}

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Figure 1 lamproie géante synapse réticulo. (A) Section de la lamproie de la moelle épinière pour indiquer l'orientation dorso-ventral. Axones réticulospinaux sont marqués avec astérisque vert. (B) la reconstruction 3-D de la synapse réticulo dans la lamproie moelle épinière montrant axone présynaptique réticulo faire de nombreux contacts en d'Passant (indiqués par des flèches vertes) sur le neurone post-synaptique ^13. Terminaisons présynaptiques ont été marquées avec Alexa Fluor 488 hydrazide phalloïdine conjuguée (vert), alors que le neurone post-synaptique a été rempli avec Alexa Fluor 568 hydrazide (rouge).

Lamproie géants axones réticulospinaux, situés dans la région ventrale de la moelle épinière parallèle à la rostrale-caudale axe Figure 1a, forme multiple pt contacts synaptiques sur les neurones Passant de lacorne ventrale de la moelle ¹⁴ Figure 1b ^13. Cellules entières macroscopique ^{Ca2 +} courants ont été enregistrés à partir des axones réticulospinaux dans la moelle épinière intacte ^13,15. Cependant, les tentatives précédentes aveugles à la mesure directe de ^{Ca2 +} courants dans les axones réticulospinaux à la lamproie moelle épinière intacte en utilisant la technique de patch-clamp cellule attachée se sont révélées inefficaces ¹³ en raison du manque d'accès à la membrane libération présynaptique de visage grâce à des processus post-synaptiques opposées Figure 1b. La membrane de la face de presse a été préalablement rendu accessible en enlevant le neurone post-synaptique ^11, la perturbation mécanique de la synapse ¹² avant l'enregistrement ou le traitement enzymatique associée à la dissociation mécanique ^16. Compte tenu de l'organisation complexe de la moelle épinière, il s'avérerait extrêmement difficile d'identifier le neurone post-synaptique et retirer mécaniquement ou perturber ee synapse. Par conséquent, nous avons décidé d'utiliser un traitement enzymatique ¹⁷ suivie par dissociation mécanique.

En utilisant cette approche, nous avons développé une préparation très dissociés de la lamproie de la moelle épinière qui donne viables axones réticulospinaux isolés avec des terminaux présynaptiques fonctionnelles dépourvues de tout processus post-synaptiques, fournissant ainsi un accès illimité aux terminaisons présynaptiques individuels. En collaboration avec un microscope standard inversé et l'imagerie de fluorescence, il nous permet d'identifier et de cibler les terminaux présynaptiques par fluorescence identifié individuels, avec une pipette de patch contenant une solution d'enregistrement qui isole ^{Ca2 +} courants figure 4C et la figure 4d, pour l'enregistrement en utilisant Cell- attaché technique voltage-clamp. ^{Ca2 +} courants ont été enregistrés directement sur ​​la membrane de presse du visage présynaptique des terminaisons présynaptiques individu Figure 4f. Il s'agit d'une significant percée dans le domaine de la transmission synaptique, car il est le premier enregistrement à effectuer au niveau des synapses centrales.