Synaptische transmissie is een zeer snelle en nauwkeurige werkwijze. Actiepotentiaal invasie van de presynaptische terminal leidt tot het openen van VGCCs gelegen in de release gezicht membraan, de daaruit voortvloeiende toename van de presynaptische Ca ^{2 +} als de trigger voor de vesikel fusie en de afgifte van neurotransmitters ^1. Al deze stappen uitgevoerd binnen honderden microseconden ^2, en dus vereisen strakke ruimtelijke koppeling van VGCCs aan de vesikel fusie machine ^3. Presynaptische Ca ^{2 +} fluxen zijn voornamelijk gekenmerkt door beeldvorming benaderingen met behulp van Ca ^{2 +} gevoelige kleurstoffen ^4. Integratie Ca2 ⁺ buffers dat Ca2 ⁺ moduleren in presynaptische neuronen is gebruikt om het verband tussen presynaptische calcium en neurotransmissie ³ indirect karakteriseren. Bovendien moduleren presynaptische vrije Ca2 ⁺ concentratie uncaging Ca2 ^{+ 5} of opname macroscopic Ca ^{2 +} stromingen zijn gebruikt in combinatie met de maatregelen van de vesikel fusie en / of vrijgave; zoals capaciteit metingen ⁶ of postsynaptische reacties ² op dezelfde vraag aan te pakken. Echter, het karakteriseren van Ca ^{2 +} stromen direct bij de release gezicht, de gespecialiseerde afdeling van de presynaptische membraan waar membraandepolarisatie wordt vertaald in Ca ^{2 +} stromen triggering synaptische vesikel fusie en de neurotransmitter release, is een integraal onderdeel van het verkrijgen van een nauwkeurige meting van de Ca ^{2 +} vereiste voor synaptische vesikel fusie. Bovendien is de mogelijkheid om direct te karakteriseren Ca2 ⁺ stromingen individuele presynaptische terminals, in combinatie met nauwkeurige simultaanmeting van vesikel fusie en vrijheid maakt een nauwkeurige opheldering van de timing tussen het tijdsverloop van de actiepotentiaal, presynaptische Ca2 ⁺ stroom, vesikel fusie en de release. De toegang tot de release gezicht membraanis niet beschikbaar in de meeste presynaptische terminals worden gesloten en aanhechting van de postsynaptische dendrieten. Deze ontoegankelijkheid is een belangrijk obstakel in de karakterisering van VGCCs omdat het voorkomt directe metingen van stroom bij individuele presynaptische terminals. Directe karakterisering van presynaptische Ca ^{2 +} stromen op individueel presynaptische terminals is tot nu toe niet mogelijk geweest in het centrum van synapsen en is alleen op twee calyceal soort presynaptische terminals; kelk-achtige synaps van het kuiken ciliaire ganglion ^7-10 en rat kelken ^11,12. In alle andere presynaptische terminals waaronder de reus reticulospinal synaps in de lamprei ruggenmerg ^13, heeft het gebrek aan toegang tot de presynaptische vrijlating gezicht membraan het gebruik van indirecte benaderingen noodzakelijk zoals Ca ^{2 +} imaging aan presynaptische Ca ^{2 +} fluxen te bestuderen.

<img alt="Figuur 1" fo: content-width = "5in" src = "/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" width = "500" />
Figuur 1 Lamprey gigantische reticulospinal synaps. (A) Dwarsdoorsnede van lamprei ruggenmerg aangeeft dorso-ventrale richting. Reticulospinal axonen zijn gemarkeerd met groene asterix. (B) 3-D reconstructie van de reticulospinal synaps in de lamprei ruggenmerg tonen presynaptische reticulospinal axon waardoor talrijke en passant contacten (gemarkeerd met groene pijlen) op de postsynaptische neuron ^13. Presynaptische terminals zijn gelabeld met Alexa Fluor 488 hydrazide geconjugeerd phalloidin (groen), terwijl de postsynaptische neuron is gevuld met Alexa Fluor 568 hydrazide (rood).

Lamprei gigantische reticulospinal axonen, gelegen in het ventrale gebied van het ruggenmerg parallel aan de rostrale-caudale as Figuur 1a, vorm meerdere en passant synaptische contacten op neuronen van despinale ventrale hoorn ¹⁴ Figuur 1b ^13. Macroscopische whole-cell Ca ^{2 +} stromen zijn opgenomen vanuit reticulospinal axonen in de intacte ruggenmerg ^13,15. Echter, eerdere blind pogingen directe meting van Ca2 ⁺ stromen in reticulospinal axons in de intacte lamprey ruggenmerg middels cel verbonden patch clamp techniek onsuccesvol ¹³ gebleken wegens gebrek aan toegang tot de presynaptische afgifte gezicht membraan wegens de tegengestelde postsynaptische processen Figuur 1b. De release gezicht membraan eerder ontsloten door verwijdering van het postsynaptische neuron ^11, mechanische verstoring van de synaps vóór opname ¹² of enzymatische behandeling in combinatie met mechanische dissociatie ^16. Gezien de complexe organisatie van het ruggenmerg, zou het uiterst moeilijk blijkt om de postsynaptische neuron te identificeren en schuif het mechanisch of verstoren the synaps. Vandaar dat we besloten om enzymatische behandeling ^17, gevolgd door mechanische dissociatie gebruiken.

Met deze aanpak hebben we een acuut gedissocieerde voorbereiding van de lamprei ruggenmerg die levensvatbare geïsoleerde reticulospinal axonen met functionele presynaptische terminals zonder enige postsynaptische processen oplevert ontwikkeld, waardoor onbeperkte toegang tot individuele presynaptische terminals. In combinatie met een standaard omgekeerde microscoop en fluorescentie beeldvorming, het stelt ons in staat om te identificeren en te richten op individuele fluorescent-geïdentificeerde presynaptische terminals, met een patch pipet met een opname oplossing die Ca ^{2 +} stromen Figuur 4c pt figuur 4d isoleert, voor het opnemen van het gebruik van cel- bijgevoegde voltage-clamp techniek. Ca ^{2 +} stromingen zijn rechtstreeks opgenomen in de presynaptische vrijlating gezicht membraan van individuele presynaptische terminals figuur 4f. Dit is een significant doorbraak op het gebied van synaptische transmissie omdat het het eerste opname uitgevoerd bij centrale synapsen worden uitgevoerd.