Синаптической передачи является чрезвычайно быстрый и точный процесс. Действие потенциал вторжение в пресинаптических окончаний приводит к открытию VGCCs расположенных в релиз лица мембраны, что привело к росту пресинаптической Са ^{2 +,} действующей в качестве триггера для слияния пузырьков и высвобождение нейромедиаторов ^1. Все эти шаги происходят в течение сотен микросекунд ^2, и, следовательно, требуют жесткой пространственной сцепление VGCCs в слияния пузырьков машин ^3. Пресинаптические Са ^{2 +} потоки были, прежде всего, характеризуется через визуализации подходов с использованием Са ² + чувствительные красители ^4. Включение Са ^{2 +} буферы, которые модулируют Са ^{2 +} в пресинаптических нейронов был использован, чтобы косвенным образом характеризует соотношение между кальцием и пресинаптических нервных импульсов ^3. Кроме того, модуляции пресинаптическое бесплатно Ca ^{2 +} концентрации по uncaging Са ^{2 + 5} или записи macroscopiС Са ^{2 +} токи были использованы в сочетании с мерами слияния пузырьков и / или высвобождения; такие как измерения емкости ⁶ или постсинаптические ответы ² для решения тот же вопрос. Однако, характеризуя Ca ^{2 +} токи непосредственно на выпуск лица, специализированный раздел пресинаптической мембраны, где деполяризация мембраны переводится в Са ^{2 +} токи вызове синаптических везикул слияние и высвобождение нейромедиаторов, является неотъемлемой точно измерить в Са ^{2 +} Требование синаптических пузырьков слияния. Кроме того, способность непосредственно характеризуют Ca2 ⁺ токи на отдельных пресинаптических окончаний, в сочетании с точной одновременных измерений слияния пузырьков и выпуска позволяет точным выяснение временной зависимости между временем ходе потенциала действия, пресинаптического Ca2 ⁺ тока, слияния пузырьков и релиз. Доступ к релиз лица мембраныне доступен в большинстве пресинаптических окончаний за счет близко друг к другу на постсинаптических дендритов. Это недоступность является одним из основных препятствий в характеристике VGCCs так как это предотвращает прямые измерения тока на отдельных пресинаптических окончаний. Прямая характеристика пресинаптических Ca ^{2 +} токов в отдельных пресинаптических окончаний до сих пор не удалось в центральных синапсах и удалось осуществить только в двух пресинаптических окончаний calyceal типа; Чашечка типа синапса из куриных мерцательная ганглий ^7-10 и крысы чашечек ^11,12. Во всех других пресинаптических окончаний включая гигантского ретикулоспинальных синапса в миноги спинного мозга ^13, отсутствие доступа к пресинаптической релиз лица мембраны потребовало использование непрямых подходов, таких как изображения Ca ^{2 +} до изучения пресинаптические Ca ^{2 +} потоков.

<img alt="Рисунок 1" fо: содержание-ширина = "5 дюймов" src = "/ файлы / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" ширина = "500" />
Рис.1 миноги гигант ретикулоспинальных синапс. (А) Сечение миноги спинного мозга с указанием Dorso-вентральной ориентацию. Ретикулоспинальных аксоны выделены зеленым звездочкой. (Б) 3-D реконструкция ретикулоспинальных синапса в миноги спинного мозга, показывая пресинаптическое ретикулоспинальных аксон делает многочисленные мимоходом контактов (отмечены зелеными стрелками) на постсинаптического нейрона ^13. Пресинаптические терминалы были помечены с Alexa Fluor 488 гидразида с сопряженными фаллоидином (зеленый), в то время как постсинаптического нейрона была заполнена Alexa Fluor 568 гидразида (красный).

Минога гигантские ретикулоспинальных аксоны, расположенные в брюшной области спинного мозга параллельно ростральной-каудальной оси рисунке 1a, образованию многочисленных мимоходом синаптических контактов на нейронахспинного вентральной рог ¹⁴ Рисунок 1б ^13. Макроскопическая цельноклеточные Са ^{2 +} токи были записаны с ретикулоспинальных аксонов в неповрежденной спинного мозга ^13,15. Тем не менее, предыдущие слепые попытки прямого измерения Са ^{2 +} токи в ретикулоспинальных аксонов в неповрежденной миноги спинного мозга с использованием методики патч зажим клеток-прилагается оказались безуспешными ¹³ в связи с отсутствием доступа к пресинаптической релиз лица мембраны вследствие противостоящих постсинаптических процессов Рисунок 1б. Высвобождение лицо мембраны были ранее доступны удалением постсинаптического нейрона ^11, механическое возмущение синапсе перед записью ¹² или ферментативной обработки в сочетании с механической диссоциации ^16. Учитывая сложный организация спинного мозга, было бы оказаться чрезвычайно трудно определить постсинаптического нейрона и убрать его механически или возмутить гоэ синапс. Таким образом, мы решили использовать ферментативную обработку ¹⁷ с последующим механической диссоциации.

Используя этот подход, мы разработали остро диссоциированную подготовку миноги спинного мозга, что дает жизнеспособные изолированных ретикулоспинальных аксоны с функциональными пресинаптических окончаниях, лишенных любых постсинаптических процессов, тем самым обеспечивая неограниченный доступ к отдельным пресинаптических окончаний. В сочетании со стандартным перевернутый микроскоп и флуоресцентных изображений, это позволяет нам выявить и против отдельных флуоресцентно-определены пресинаптические терминалы, с помощью патча пипетки, содержащую раствор записи, который изолирует Ca ^{2 +} токи Фиг.4С и рисунок 4d, для записи с помощью сотового прилагается метода фиксации. Са ^{2 +} токи были записаны непосредственно на пресинаптической релиз лица мембраны индивидуального пресинаптических окончаний рисунке 4е. Это significaнт прорыв в области синаптической передачи, так как это первый такой записи будет осуществляться в центральных синапсах.