Summary

Tillämpning av Two-spotted Spider Mite<em> Tetranychus urticae</em> För växt-skadegörare Interaktionsstudier

Published: July 04, 2014
doi:

Summary

Protokoll för effektiv beredning av homogena prover av spinnkvalster, angrepp av experimentella växter och bedömningen av växtskador, vilket krävs för studier av samspelet växt-pest utvecklades.

Abstract

De två växthusspinnkvalster, Tetranychus urticae, är en allestädes närvarande polyphagous leddjur växtätare som livnär sig på ett anmärkningsvärt brett spektrum av arter, med mer än 150 av ekonomiskt värde. Det är ett stort skadedjur av växthusgrödor, särskilt i Solanaceae och Cucurbitaceae (t.ex., tomater, auberginer, paprika, gurka, zucchini) och växthusprydnadsväxter (t.ex. rosor, krysantemum, nejlikor), årliga fältgrödor (såsom majs, bomull, sojabönor och sockerbetor), och i perenna kulturer (alfalfa, jordgubbar, druvor, citrus, och plommon) 1,2. Förutom den extrema polyphagy som gör det till en viktig jordbruks skadedjur, T. urticae har en tendens att utveckla resistens mot ett brett spektrum av insekticider och kvalstermedel som används för dess kontroll 3-7.

T. urticae är en utmärkt experimentell organism, eftersom det har en snabb livscykel (7 dagar vid 27 ° C)och kan lätt upprätthållas vid hög densitet i laboratoriet. Metoder för att analysera genuttryck (inklusive in situ hybridisering och antikroppsfärgning) och inaktivera uttrycket av spindel kvalster endogena gener med hjälp av RNA-interferens har utvecklats 8-10. Nyligen, den hela genom ordnar av T. urticae har rapporterats, vilket skapar en möjlighet att utveckla denna skadegörare växtätare som modellorganism med motsvarande iska resurser som redan finns i några av sina värdväxter (Arabidopsis thaliana och tomaten Solanum lycopersicum) 11. Tillsammans kan dessa modellorganismer ge insikter i molekylära grunderna för växt-skadegörare interaktioner.

Här är en effektiv metod för snabb och enkel samling av ett stort antal vuxna kvinnliga kvalster, deras tillämpning på experimentell växtvärden, och bedömningen av växtskador på grund av spinn utfodring beskrivs. Den presenterade protokollet svkundfordringar snabb och effektiv samling av hundratals personer vid varje utvecklingsstadium (ägg, larver, nymfer, vuxna hannar och honor) som kan användas för efterföljande försöket.

Introduction

Interaktion Växt skadedjur är ett ämne av stor vetenskaplig och ekonomisk betydelse. Det var historiskt studeras med hjälp av både grödor (t.ex. tomat) och modellväxten, A. thaliana. I båda fallen kunde känsligheten hos växten till gräsätande mätas antingen direkt genom bedömning av växtfenotyp efter herbivore angrepp eller indirekt genom bedömning av skadedjur prestanda.

Direkta mätningar av växt känslighet utnyttjades tidigare för ett antal insektsarter med hjälp av en rad olika metoder. Till exempel är herbivory av lepidoptera-larver mättes som en uppskattning av den del av växtvävnad som förbrukas av antingen Plutella xylostella (kålmal) eller Trichoplusia ni (cabbage looper) med blotta ögat med hjälp av ett galler 12. Också, finns det metoder som utnyttjar digital avbildning av bladskador med efterföljande kvantitativ bildanalys. Sådana metoder användes istudier av A. thaliana interaktion med Frankliniella occidentalis (västra blomma trips) 13, Scaptomyza flava (blad-mining drosophila) 14, och T. ni 15.

Indirekta mätningar av växt känslighet används ofta i studier av samspelet växt-skadegörare. Exempelvis mottagligheten hos A. thaliana att persika bladlöss Myzus persicae herbivori normalt bedöms genom analys av skadedjur fruktbarhet och beskrivning av brutto morfologi av en anläggning efter interaktion 16,17. En annan typisk indirekt indikator på A. thaliana mottaglighet för ett skadedjur är en torr eller våt vikt bedömning av gräsätande. Denna parameter används ofta för att karakterisera herbivory av lepidoterans såsom Pieris rapae (liten vit), P. xylostella eller T. ni på deras larver eller PUPP steg 15,17.

Spider kvalster är cell-innehåll feEders. Mite-inducerad skador erkänns som en samling chlorotic fläckar som varierar i färg från vit till blekt grönt. Risken för att en anläggning värd för spinn herbivory tidigare bedömts antingen indirekt genom analys av spindel kvalster prestanda dagar efter angrepp 18,19, eller direkt med grov morfologi av växter veckor efter angrepp 18 eller med hjälp av en digital avbildning av löv exponerade mot kvalster i dagar med efterföljande automatiserad bildanalys 19. Dessa metoder utvecklas och används för studier av växelverkan mellan tomatplantor och T. urticae, och används typiskt litet antal spinnkvalster (5-15 per behandling) som samlades in från den blandade kvalsterpopulationen och släppts ut på bladytan med en mjuk borste. Men dessa metoder är inte lämpliga för studier där ett större antal kvalster måste tillämpas. Dessutom, medan direkt bearbetning av blad bilder i bildanalysmjukvaratill exempel Adobe Photoshop (San Jose, CA) eller ImageJ 20 kan användas för analys av tomatskador, dessa protokoll behöver ändras för att kunna tillämpas på bladen som har större reflektionsförmåga av ytan eller är lätt färgad och har mycket synliga trichomes ( t.ex. A. thaliana) som stör automatiserad urval av chlorotic fläckar som markerar växtskador. Dessutom är utvecklingsstadiet av spinnkvalster som lätt kan utnyttjas med de tidigare metoderna begränsade till de vanligaste och lätt identifierbara vuxna kvinnor och utesluter utnyttjande av andra utvecklingsstadier.

Den första kritiska steget mot high-throughput analys av växt-spinn interaktion är att skapa reproducerbara, enkla och robusta protokoll för att utmana växter med spindelkvalster och tillförlitligt bedöma interaktions utfall.

I den här filmen, en effektiv metod för snabb och enkel samling av ett stort numlet vuxna kvinnliga kvalster, är deras tillämpning på experimentell växtvärden, och bedömningen av växtskador på grund av spinn utfodring beskrivs. Den presenterade protokollet möjliggör snabb och effektiv uppsamling av hundratals personer vid varje utvecklingsstadium (ägg, larver, nymfer, vuxna hannar och honor) som kan användas för efterföljande försöket. Dessutom kan dessa protokoll tillämpas på alla kvalster värdväxt, men som särskilt visats i fallet med A. thaliana.

Protocol

1. Underhåll av Spider Mite Befolkning OBS: Spider kvalster föds upp på Kaliforniens röda kidneybönor (Phaseolus vulgaris). Odla böna växter från frön i 2-3 veckor före angrepp. Intermix dessa växter med angripna växter; vuxna kvalster kommer snabbt kolonisera färska växtmaterial. Ta bort gamla angripna bönplantor var 7-10 dagar, ersätta dem med färska växter. 2. Samla vuxna kvinnliga kvalster …

Representative Results

Med hjälp av 20 till 30 angripna böna växter, kan man samlar in omkring 2.000 vuxna kvinnliga kvalster med användning av siktar. Den tid som krävs för att angripa 10 anläggningar med 20 kvalster per anläggning är cirka 15 minuter om du använder en borste för att överföra kvalster. Kombinationer av insamlings-och appliceringsmetoder visas i figur 2. Detta protokoll ger reproducerbara resultat av växtskador, visar att insamlade kvalster är av liknande fysiologis…

Discussion

Denna video visar protokoll som används för att isolera och att angripa växter med ett stort antal vuxna kvinnliga kvalster. Även om vi presenterade detta protokoll med hjälp av A. thaliana, kan den användas för någon växt-spinn interaktion systemet och för närvarande med framgång tillämpas även på tomat och vinranka (Vitis vinifera) växter. Protokollet ger reproducerbara resultat, vilket indikerar att insamlade kvalster är av jämförbar fysiologiska tillstånd (Figur 3).</str…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).

Materials

Plant material:
California red kidney bean Stokes, Thorold, ON, Canada NA Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used.
Chemicals:
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting
Tap water Any supplier NA At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance
Other materials and equipment:
Plastic tray Any supplier NA
Set of scissors Any supplier NA
2 L beakers Any supplier NA
Paper towels Any supplier NA
Sets of sieves Manufactured in house NA Detailed instructions are available
Thin brush Any supplier NA
Pipettes Any supplier NA
Pipette tips Any supplier NA 0.2 and 1 mL
1.5 mL centrifuge tubes Any supplier NA
Air pump Any supplier NA Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi
Stereoscope Any supplier NA
Scanner Epson V30 Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments.
Computer Any supplier NA Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software.
Adobe Photoshop software Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA various Any version with Histogram tool included.

Referências

  1. Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. . Mites injurious to economic plants. , (1975).
  2. Migeon, A., Dorkeld, F. Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae. http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).
  3. Croft, B. A., Vandebaan, H. E. Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites. Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).
  4. Van Leeuwen, T., et al. Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).
  5. Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review. Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).
  6. Dermauw, W., et al. The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance. Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).
  7. Van Leeuwen, T., et al. Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).
  8. Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Development. 129, 5461-5472 (2002).
  9. Khila, A., Grbic, M. Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene. Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).
  10. Grbic, M., et al. Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).
  11. Grbic, M., et al. The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations. Nature. 479, 487-492 (2011).
  12. Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana. Genética. 161, 325-332 (2002).
  13. Abe, H., et al. Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding. Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).
  14. Whiteman, N. K., et al. Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis. Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).
  15. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).
  16. Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid). The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).
  17. Adio, A. M., et al. Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite. Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).
  18. Li, L., et al. The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development. Plant Cell. 16, 126-143 (2004).
  19. Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants. Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
check_url/pt/51738?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Cazaux, M., Navarro, M., Bruinsma, K. A., Zhurov, V., Negrave, T., Van Leeuwen, T., Grbic, V., Grbic, M. Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies. J. Vis. Exp. (89), e51738, doi:10.3791/51738 (2014).

View Video