Aplicación de descubierto en dos de Spider Mite<em> Tetranychus urticae</em> Estudios interacción planta-plaga
Summary
Los protocolos para la preparación eficaz de las muestras homogéneas de la araña roja, la infestación de plantas experimentales y la evaluación de daños en las plantas, como se requiere para los estudios de interacción planta-plaga se desarrollaron.
Abstract
El ácaro de la araña de dos manchas, Tetranychus urticae, es un herbívoro artrópodos polífagas ubicuo que se alimenta de una notable amplia gama de especies, con más de 150 de valor económico. Es una de las principales plagas de los cultivos de invernadero, especialmente en las Solanáceas y Cucurbitáceas (por ejemplo, tomates, berenjenas, pimientos, pepinos, calabacín) y plantas ornamentales de invernadero (por ejemplo, rosas, crisantemos, claveles), cultivos extensivos anuales (como el maíz, el algodón, soja y remolacha azucarera), y en cultivos perennes (alfalfa, fresas, uvas, cítricos y ciruelas) 1,2. Además de la polifagia extrema que hace que sea una plaga agrícola importante, T. urticae tiene una tendencia a desarrollar resistencia a una amplia variedad de insecticidas y acaricidas que se utilizan para su control 3-7.
T. urticae es un organismo experimental excelente, ya que tiene un ciclo de vida rápido (7 días a 27 ° C)y puede ser fácilmente mantenido a alta densidad en el laboratorio. Métodos de ensayo de la expresión génica (incluyendo la hibridación in situ y tinción de anticuerpos) y para inactivar la expresión de genes endógenos de ácaros araña utilizando la interferencia de ARN se han desarrollado 8-10. Recientemente, toda la secuencia del genoma de T. urticae ha informado, creando una oportunidad para el desarrollo de este herbívoro plaga como organismo modelo con recursos genómicos equivalentes que ya existen en algunas de sus plantas hospederas (Arabidopsis thaliana y el Solanum lycopersicum tomate) 11. Juntos, estos organismos modelo podría ayudar a comprender las bases moleculares de las interacciones planta-plaga.
Aquí, un método eficiente para la recogida rápida y sencilla de un gran número de ácaros hembras adultas, su aplicación en un host de planta experimental, y la evaluación de los daños a las plantas debido a la alimentación del ácaro araña se describen. El protocolo presentado enables colección rápido y eficiente de los cientos de personas en cualquier etapa de desarrollo (huevos, larvas, ninfas, adultos machos, y las hembras) que se puede utilizar para la aplicación experimental posterior.
Introduction
Interacción planta-plaga es un tema de gran importancia científica y económica. Se estudió históricamente el uso de ambas plantas de cultivo (tales como el tomate) y el modelo de planta, A. thaliana. En ambos casos, la susceptibilidad de las plantas a los herbívoros se podía medir de forma directa a través de la evaluación del fenotipo de la planta después de un ataque de herbívoros o indirectamente a través de la evaluación del desempeño de plagas.
Las mediciones directas de susceptibilidad de las plantas se utilizaron previamente para un número de especies de plagas de insectos usando una gama de métodos. Por ejemplo, la herbivoría de larvas de lepidópteros se mide como una estimación de la porción de tejido de la planta consumida por cualquiera de Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante) o Trichoplusia ni (gusano falso medidor) por el ojo desnudo con la ayuda de una rejilla 12. Además, existen métodos que utilizan la imagen digital de daño de la hoja con el posterior análisis de imagen cuantitativo. Tales métodos se utilizaron enestudios de A. interacción con Frankliniella occidentalis thaliana (trips occidental de las flores) 13, Scaptomyza flava (drosophila hoja-minería) 14, y T. NI 15.
Mediciones indirectas de la susceptibilidad de las plantas son ampliamente utilizados en los estudios de interacción planta-plaga. Por ejemplo, la susceptibilidad de A. thaliana a melocotón áfido Myzus persicae herbivoría se evalúa típicamente a través de análisis de la fecundidad de las plagas y descripción de la morfología bruto de una planta después de la interacción 16,17. Otro indicador indirecto típico de A. thaliana susceptibilidad a una plaga es una evaluación de peso seco o húmedo del herbívoro. Este parámetro se utiliza para caracterizar la herbivoría de lepidoterans, tales como Pieris rapae (pequeño blanco), P. xylostella, o T. ni a su larvas o pupal etapas 15,17.
Los ácaros son células contenido de FeEders. Daño inducido Mite-es reconocida como una colección de manchas cloróticas que varían en color de blanco a verde pálido. La susceptibilidad de una planta huésped a la herbivoría araña roja se evaluó previamente, ya sea indirectamente a través del análisis de los días de función araña después de la infestación de 18,19, o directamente a través de la morfología bruto de plantas semanas después de la infestación de 18 o usando una imagen digital de las hojas expuestas a los ácaros por día con el posterior análisis automatizado de imágenes 19. Estos métodos se están desarrollando y utilizando para el estudio de las interacciones entre las plantas de tomate y T. urticae, y por lo general se utiliza un pequeño número de ácaros de la araña (5-15 por tratamiento) que se recogieron a partir de la población de ácaros mixta y se colocaron en la superficie de las hojas usando un cepillo de cerdas suaves. Sin embargo, estos métodos no son adecuados para estudios en los que un mayor número de ácaros se deben aplicar. Además, mientras que el procesamiento directo de las imágenes de la hoja en el software de análisis de imágenestales como Adobe Photoshop (San José, CA) o ImageJ 20 se pueden utilizar para el análisis de daño de tomate, estos protocolos requieren una modificación con el fin de ser aplicado a las hojas que tienen una mayor reflectividad de la superficie o están ligeramente coloreados y tienen tricomas altamente visibles ( por ejemplo, A. thaliana) que interfieren con la selección automatizada de manchas cloróticas que marcan daños a las plantas. Además, la etapa de desarrollo de los ácaros araña que se pueden utilizar fácilmente con los métodos anteriores se limita a las hembras adultas más prevalentes y fácilmente identificables y se opone a la utilización de otras etapas de desarrollo.
El primer paso crítico para análisis de alto rendimiento de la interacción planta-ácaro araña es establecer protocolos reproducibles, simples y robustas para desafiar a las plantas con la araña roja y fiable evaluar los resultados de la interacción.
En este vídeo, un método eficiente para la recogida rápida y sencilla de un gran númeromero de ácaros hembras adultas, su aplicación en un host de planta experimental, y la evaluación de los daños a las plantas debido a la alimentación del ácaro araña se describen. El protocolo presentado permite la recolección rápido y eficiente de los cientos de personas en cualquier etapa de desarrollo (huevos, larvas, ninfas, adultos machos, y las hembras) que se puede utilizar para la aplicación experimental posterior. Además, estos protocolos se pueden aplicar a cualquier planta huésped ácaros, pero se demuestran específicamente en el caso de A. thaliana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este video muestra los protocolos que se utilizan para aislar y para infestar las plantas con un gran número de ácaros hembras adultas. Aunque hemos presentado este protocolo utilizando A. thaliana, que puede ser utilizado para cualquier sistema de interacción ácaro araña planta-y en la actualidad se está aplicando con éxito también en plantas de tomate y de vid (Vitis vinifera). Los rendimientos de protocolo resultados reproducibles, lo que indica que los ácaros son recogidos de estado fisiol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).
Materials
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | NA | Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | Any supplier | NA | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance |
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | Any supplier | NA | – |
| Set of scissors | Any supplier | NA | – |
| 2 L beakers | Any supplier | NA | – |
| Paper towels | Any supplier | NA | – |
| Sets of sieves | Manufactured in house | NA | Detailed instructions are available |
| Thin brush | Any supplier | NA | – |
| Pipettes | Any supplier | NA | – |
| Pipette tips | Any supplier | NA | 0.2 and 1 mL |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Any supplier | NA | – |
| Air pump | Any supplier | NA | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi |
| Stereoscope | Any supplier | NA | – |
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Any supplier | NA | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. |
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
Referências
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