Применение Два выставления паутинный клещ<em> Tetranychus Urticae</em> Для растений-вредителей взаимодействию исследований
Summary
Протоколы для эффективной подготовки однородных образцов паутинных клещей, вредителей экспериментальных растений и оценки ущерба растений, как это требуется для исследований растений вредителями взаимодействия были разработаны.
Abstract
Два-пятнистый паутинный клещ, Tetranychus Urticae, является повсеместное многоядны членистоногих травоядное который питается удивительно широкого спектра видов, с более чем 150 из экономической ценности. Она является основным вредителем тепличных культур, особенно в пасленовых и тыквенных (например, помидоры, баклажаны, перец, огурцы, цуккини) и парниковых украшения (например, розы, хризантемы, гвоздики), годовые полевых культур (таких как кукуруза, хлопок, соя, и сахарная свекла), а в многолетних культур (люцерна, клубника, виноград, цитрусовые, и сливы) 1,2. В дополнение к крайней полифагии, что делает его важным сельскохозяйственным вредителем, Т. Urticae имеет тенденцию к развитию устойчивость к широкому спектру инсектицидов и акарицидов, которые используются для его контролем 3-7.
Т. Urticae является отличным экспериментальный организм, так как она имеет быстрое жизненный цикл (7 дней при 27 ° С)и может быть легко поддерживать при высокой плотности в лаборатории. Методы анализа экспрессии генов (в том числе в гибридизация и окрашивания антител) и инактивируют выражение паутинного клеща эндогенных генов с помощью РНК-интерференции были разработаны 8-10. В последнее время вся последовательность генома T. Urticae сообщалось, создавая возможности для развития этого вредителя травоядных в качестве модельного организма с эквивалентными геномных ресурсов, которые уже существуют в некоторых своих растений-хозяев (арабидопсис и томатный Solanum Lycopersicum) 11. Вместе эти модельные организмы могли дать ответ на молекулярных основ завод-вредителей взаимодействий.
Здесь, эффективный метод для быстрого и легкого сбора большого количества взрослых самок клещей, их применения на экспериментальной растения-хозяина, и оценки ущерба растений из-за паутинный клещ кормления описаны. Представленный протокол анAbles быстрый и эффективный сбор сотен людей на любом этапе развития (яйца, личинки, нимфы, взрослые мужчины, и женщины), которые могут быть использованы для последующей экспериментальной применения.
Introduction
Завод-вредителями взаимодействие является тема представляет большой научное и экономическое значение. Это исторически изучены с использованием как культурные растения (например, помидор) и модель завода, А. THALIANA. В обоих случаях, восприимчивость растений к травоядным можно измерить либо непосредственно через оценке фенотипа растений после травоядных нападения или косвенно, через оценки эффективности борьбы с вредителями.
Прямые измерения растений восприимчивости были использованы ранее для ряда видов насекомых-вредителей, используя ряд методов. Например, herbivory чешуекрылых личинок измеряется как оценки части растительной ткани, потребляемой либо Plutella xylostella (капустной моли) или Trichoplusia Ni (совка) невооруженным глазом с помощью сетки 12. Кроме того, существуют методы, которые используют цифровую съемку повреждения листьев с последующим количественным анализом изображения. Такие методы были использованы висследования А. THALIANA взаимодействие с Frankliniella западная (западные цветочный трипс) 13, Scaptomyza Flava (минирующих дрозофила) 14 и Т. Ni 15.
Косвенные измерения растительного восприимчивости широко используются в исследованиях растений вредителями взаимодействия. Например, восприимчивость А. THALIANA чтобы персиковая тля Myzus persicae herbivory обычно оценивается с помощью анализа с вредителями плодовитости и описание валового морфологии растений после взаимодействия 16,17. Другой типичный косвенным показателем А. THALIANA восприимчивость к вредителя является сухой или влажный оценка вес травоядного. Этот параметр обычно используется для характеристики herbivory из lepidoterans, например Pieris rapae (маленький белый), P. xylostella или Т. Ni на их личинок или куколок этапы 15,17.
Паутинный клещ являются клетки-Содержание Feeders. Повреждение Клещ-индуцированной признан коллекции хлоротичных пятен, которые варьируются по цвету от белого до бледно-зеленого цвета. Восприимчивость растения-хозяина к паутинный клещ herbivory ранее оценивали либо косвенно через анализ дней паук производительности клеща после заражения 18,19, или непосредственно валовой морфология растений недель после вредителей 18 или с помощью цифровых изображений листьев подвергается с клещами в течение нескольких дней с последующим автоматизированного анализа изображений 19. В настоящее время разрабатываются Эти методы и используется для изучения взаимодействий между томатов и Т. Urticae, и обычно используется в небольших количествах паутинного клеща (5-15 за лечение), которые были собраны из смешанного населения клеща и были размещены на поверхности листьев, используя щетку с мягкой щетиной. Однако эти способы не подходят для исследований, в которых большее число клещей должны быть применены. Кроме того, в то время как непосредственная обработка листовых изображений в программном обеспечении для анализа изображенийтакие как Adobe Photoshop (San Jose, CA) или ImageJ 20 может быть использован для анализа повреждений томатов, эти протоколы требуют модификации для того, чтобы быть применены к листьев, которые имеют большую отражательную способность поверхности или слегка окрашенных и имеют хорошо видимые трихомы ( например, А. THALIANA), что мешает автоматизированной отбора хлоротичных пятен, которые отмечают повреждения растений. Кроме того, стадия развития паутинных клещей, которые могут быть легко использованы с предыдущими методами ограничивается наиболее распространенных и легко идентифицируемых взрослых самок и исключает использование других стадиях развития.
Первый критический шаг к высокой пропускной анализа растений паутинный клещ взаимодействия является установление воспроизводимые, простые и надежные протоколы, чтобы бросить вызов растения с паутинного клеща и надежно оценивать результаты взаимодействия.
В этом видео, эффективный метод для быстрого и легкого сбора большого питBER взрослых самок клещей, их применение на экспериментальной растения-хозяина, и оценки ущерба растений из-за паутинный клещ кормления описаны. Представленный протокол позволяет быстро и эффективно коллекцию сотен людей на любом этапе развития (яйца, личинки, нимфы, взрослые мужчины, и женщины), которые могут быть использованы для последующей экспериментальной применения. Кроме того, эти протоколы могут быть применены к любому хост-клещ растения, но конкретно продемонстрировано в случае А. THALIANA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это видео демонстрирует протоколы, используемые для изоляции и заражать растения с большим количеством взрослых самок клещей. Хотя мы представили этот протокол, используя A. THALIANA, он может быть использован для любого завода-паука системе клеща взаимодействия и в настоящее время у?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).
Materials
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | NA | Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | Any supplier | NA | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance |
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | Any supplier | NA | – |
| Set of scissors | Any supplier | NA | – |
| 2 L beakers | Any supplier | NA | – |
| Paper towels | Any supplier | NA | – |
| Sets of sieves | Manufactured in house | NA | Detailed instructions are available |
| Thin brush | Any supplier | NA | – |
| Pipettes | Any supplier | NA | – |
| Pipette tips | Any supplier | NA | 0.2 and 1 mL |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Any supplier | NA | – |
| Air pump | Any supplier | NA | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi |
| Stereoscope | Any supplier | NA | – |
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Any supplier | NA | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. |
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
Referências
- Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. . Mites injurious to economic plants. , (1975).
- Migeon, A., Dorkeld, F. Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae. http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).
- Croft, B. A., Vandebaan, H. E. Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites. Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).
- Van Leeuwen, T., et al. Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).
- Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review. Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).
- Dermauw, W., et al. The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance. Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).
- Van Leeuwen, T., et al. Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).
- Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Development. 129, 5461-5472 (2002).
- Khila, A., Grbic, M. Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene. Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).
- Grbic, M., et al. Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).
- Grbic, M., et al. The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations. Nature. 479, 487-492 (2011).
- Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana. Genética. 161, 325-332 (2002).
- Abe, H., et al. Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding. Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).
- Whiteman, N. K., et al. Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis. Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).
- Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).
- Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid). The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).
- Adio, A. M., et al. Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite. Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).
- Li, L., et al. The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development. Plant Cell. 16, 126-143 (2004).
- Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants. Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
