Aplicação de duas avistou Ácaro<em> Tetranychus urticae</em> De Estudos Planta-praga de Interação
Summary
Protocolos para preparação eficiente de amostras homogêneas de ácaros, infestação de plantas experimentais e avaliação de danos às plantas, como requerido para estudos de interação planta-praga foram desenvolvidos.
Abstract
O ácaro-rajado, Tetranychus urticae, é um herbívoro de artrópodes polífagas onipresente que se alimenta de uma notavelmente ampla gama de espécies, com mais de 150 de valor econômico. É uma das principais pragas das culturas de estufa, especialmente em Solanaceae e Cucurbitaceae (por exemplo, tomates, beringelas, pimentos, pepinos, abobrinha) e plantas ornamentais de efeito estufa (por exemplo, rosas, crisântemos, cravos), culturas anuais (como o milho, o algodão, soja e açúcar de beterraba) e em culturas perenes (alfafa, morangos, uvas, frutas cítricas, e ameixas) 1,2. Além do polyphagy extremo que torna uma importante praga agrícola, T. urticae tem uma tendência para desenvolver a resistência a uma vasta gama de insecticidas e acaricidas que são usados para o seu controlo 3-7.
T. urticae é um excelente organismo experimental, uma vez que tem um ciclo de vida rápido (7 dias a 27 ° C)e podem ser facilmente mantidas a uma densidade elevada no laboratório. Métodos de Ensaio para a expressão do gene (incluindo a hibridização in situ e a coloração do anticorpo) e para inactivar a expressão dos genes endógenos de ácaros de aranha com RNA de interferência foram desenvolvidos 8-10. Recentemente, toda a seqüência do genoma de T. urticae foi relatado, criando uma oportunidade para desenvolver este herbívoro de pragas como um organismo modelo com recursos equivalentes genômicos que já existem em algumas de suas plantas hospedeiras (Arabidopsis thaliana eo Solanum lycopersicum tomate) 11. Juntos, esses organismos modelo pode fornecer insights sobre bases moleculares das interações planta-praga.
Aqui, um método eficiente para a coleta rápida e fácil de um grande número de ácaros adultos do sexo feminino, a sua aplicação em uma planta hospedeira experimental ea avaliação dos danos planta devido à alimentação ácaro são descritos. O protocolo apresentado enables recolha rápida e eficiente de centenas de pessoas, em qualquer estádio de desenvolvimento (ovos, larvas, ninfas, machos adultos e fêmeas) que pode ser utilizado para aplicação experimental subsequente.
Introduction
Interação planta-praga é um tema de grande importância científica e econômica. Foi estudado historicamente usando as duas plantas de cultivo (como o tomate) e da planta modelo, A. thaliana. Em ambos os casos, a suscetibilidade da planta de herbívoros pode ser medido diretamente por meio de avaliação de fenótipo da planta após o ataque herbívoro ou indiretamente, por meio da avaliação do desempenho de pragas.
Medidas diretas de suscetibilidade da planta foram utilizados anteriormente para um número de espécies de insetos-praga usando uma variedade de métodos. Por exemplo, pragas de larvas de lepidópteros é medido como uma estimativa da porção de tecido da planta consumida por qualquer Plutella xylostella (traça de Diamondback) ou Trichoplusia ni (lagarta da couve), a olho nu, com a ajuda de uma grelha 12. Além disso, existem métodos que utilizam a imagem digital de dano foliar com posterior análise de imagem quantitativa. Tais métodos foram utilizados emestudos de A. interação thaliana com Frankliniella occidentalis (tripes flor ocidentais) 13, Scaptomyza flava (drosófila folha de mineração) 14, e T. ni 15.
As medidas indiretas de suscetibilidade da planta são amplamente utilizados em estudos de interação planta-praga. Por exemplo, a susceptibilidade de A. thaliana de pêssego pulgão Myzus persicae herbivoria normalmente é avaliada através da análise de fecundidade pragas e descrição da morfologia de uma planta após interação 16,17. Outro indicador indirecto típico de A. thaliana suscetibilidade à praga é uma avaliação de peso seco ou molhado do herbívoro. Este parâmetro é utilizado para caracterizar a herbivoria de lepidoterans, como Pieris rapae (pequeno branco), P. xylostella, ou T. ni em seu larval ou de pupa encena 15,17.
Ácaros são-conteúdo da célula feEders. Induzida por danos Mite é reconhecida como uma coleção de manchas cloróticas que variam em cor do branco ao verde pálido. A susceptibilidade de uma planta hospedeira para ácaro herbivoria foi previamente avaliada quer indirectamente através da análise de desempenho ácaro dias pós-infestação 18,19, ou diretamente usando morfologia de plantas semanas pós-infestação de 18 ou usando uma imagem digital de folhas expostas aos ácaros por dias com posterior análise de imagem automatizado 19. Estes métodos foram sendo desenvolvidos e utilizados para estudos de interações entre plantas de tomate e T. urticae, e normalmente usado um pequeno número de ácaros (5-15 por tratamento) que foram coletados a partir da população de ácaros mista e foram colocados na superfície da folha, utilizando uma escova de cerdas macias. No entanto, estes métodos não são adequados para estudos em que um maior número de ácaros precisam de ser aplicados. Além disso, durante o processamento direto de imagens de folhas de software de análise de imagemcomo o Adobe Photoshop (San Jose, CA) ou ImageJ 20 pode ser utilizado para a análise de danos tomate, estes protocolos de modificação precisa, a fim de ser aplicado a folhas, que têm uma maior reflectividade da superfície ou são levemente coloridas e possuem tricomas altamente visíveis ( por exemplo, A. thaliana) que interferem com a seleção automática de manchas cloróticas que marcam danos às plantas. Além disso, a fase de desenvolvimento de ácaros que podem ser facilmente utilizados com os métodos anteriores, é limitada às fêmeas adultas mais prevalentes e facilmente identificáveis e opõe-se a utilização de outras fases de desenvolvimento.
O primeiro passo crítico para análise de alto rendimento de interação planta-ácaro aranha é estabelecer, protocolos simples e robustas reprodutíveis para desafiar plantas com ácaros e confiável avaliar os resultados de interação.
Neste vídeo, um método eficiente para a coleta rápida e fácil de um grande númemero de ácaros fêmeas adultas, a sua aplicação em uma planta hospedeira experimental ea avaliação dos danos planta devido à alimentação ácaro são descritos. O protocolo apresentado permite a recolha rápida e eficiente de centenas de pessoas, em qualquer estádio de desenvolvimento (ovos, larvas, ninfas, machos adultos e fêmeas) que pode ser utilizado para aplicação experimental subsequente. Além disso, estes protocolos podem ser aplicados a qualquer planta hospedeira ácaro, mas são especificamente demonstrado no caso de A. thaliana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este vídeo demonstra protocolos utilizados para isolar e infestam plantas com grandes números de ácaros fêmeas adultas. Embora nós apresentamos esse protocolo usando A. thaliana, ele pode ser usado para qualquer sistema de interação planta-ácaro aranha e atualmente está sendo aplicado com sucesso também em plantas de tomateiro e videira (Vitis vinifera). Os rendimentos de protocolo de resultados reprodutíveis, indicando que os ácaros coletados são do estado fisiológico comparável <strong…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).
Materials
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | NA | Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | Any supplier | NA | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance |
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | Any supplier | NA | – |
| Set of scissors | Any supplier | NA | – |
| 2 L beakers | Any supplier | NA | – |
| Paper towels | Any supplier | NA | – |
| Sets of sieves | Manufactured in house | NA | Detailed instructions are available |
| Thin brush | Any supplier | NA | – |
| Pipettes | Any supplier | NA | – |
| Pipette tips | Any supplier | NA | 0.2 and 1 mL |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Any supplier | NA | – |
| Air pump | Any supplier | NA | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi |
| Stereoscope | Any supplier | NA | – |
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Any supplier | NA | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. |
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
Referências
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