Summary

Anvendelse av Two-spotted Spider Mite<em> Tetranychus urticae</em> For Plant-pest interaksjonsstudier

Published: July 04, 2014
doi:

Summary

Protokoller for effektiv utarbeidelse av homogene prøver av edderkopp midd, angrep av eksperimentelle planter, og vurdering av anlegget skader, slik det kreves for studier av plante-pest interaksjon ble utviklet.

Abstract

De to-spotted spider mite, Tetranychus urticae, er en allestedsnærværende polyphagous leddyr herbivore som strømmer på en bemerkelsesverdig bredt spekter av arter, med mer enn 150 av økonomisk verdi. Det er en stor pest av klima avlinger, spesielt i solanaceae og Cucurbitaceae (f.eks, tomater, auberginer, paprika, agurk, squash) og klimapryd (f.eks, roser, krysantemum, nelliker), årlige jordbruksvekster (som mais, bomull, soyabønner, og sukkerroer), og i flerårige kulturer (alfalfa, jordbær, druer, sitrus og plommer) 1,2. I tillegg til det ytterste polyphagy som gjør det til et viktig landbruks pest, T. urticae har en tendens til å utvikle resistens mot et bredt utvalg av insekticider og acaricider som benyttes for sin styring 3-7.

T. urticae er en utmerket eksperimentell organisme, som det har en hurtig livssyklus (7 dager ved 27 ° C), og kan lett opprettholdes ved høy tetthet i laboratoriet. Metoder for å bestemme genekspresjon (inkludert in situ hybridisering og antistoffarging), og for å inaktivere ekspresjon av edderkoppmidd endogene gener ved hjelp av RNA-interferens er blitt utviklet 8-10. Nylig har hele genomsekvens av T. urticae har blitt rapportert, og skaper en mulighet til å utvikle denne pest herbivore som modellorganisme med tilsvarende genomisk ressurser som allerede finnes i noen av sine vertsplanter (Arabidopsis thaliana og tomat Solanum Lycopersicum) 11. Sammen kan disse modellorganismer gi innsikt i molekylære grunnlaget for plantevern interaksjoner.

Her er en effektiv metode for rask og enkel samling av et stort antall voksne hunnmidd, deres anvendelse på en eksperimentell plante-vert, og vurderingen av anlegget skade på grunn av spider mite foring beskrevet. Den presenterte protokollen noringen er rask og effektiv innsamling av hundrevis av personer på ethvert utviklingsstadiet (egg, larver, nymfer, voksne menn, og kvinner) som kan benyttes til senere eksperimentelt program.

Introduction

Plant-pest interaksjon er et tema av stor vitenskapelig og økonomisk betydning. Det var historisk studert ved hjelp av både planter (for eksempel tomat) og modell anlegg, A. thaliana. I begge tilfeller kunne mottakelighet for anlegget til planteeter måles enten direkte gjennom vurdering av plante fenotype etter herbivore angrep eller indirekte ved vurderingen av pest ytelse.

Direkte målinger av plante mottakelighet ble benyttet tidligere for et antall insekt skadedyr ved hjelp av en rekke metoder. For eksempel er herbivory av lepidopteran-larver målt som en estimering av det parti av plantevev som forbrukes av enten Plutella xylostella (diamant møll) eller Trichoplusia ni (kål sløyfen) ved det blotte øye ved hjelp av et gitter 12.. Også, det finnes metoder som utnytter digital avbildning av blad skade med påfølgende kvantitativ bildeanalyse. Slike fremgangsmåter ble brukt istudier av A. thaliana interaksjon med Frankliniella occidentalis (vestlige blomst thrips) 13, Scaptomyza flava (blad-mining Drosophila) 14, og T. ni 15.

Indirekte målinger av plante mottakelighet er mye brukt i studier av plante-pest interaksjon. For eksempel susceptibility of A. thaliana å fersken bladlus Myzus persicae herbivory er vanligvis vurderes gjennom analyse av pest fruktbarhet og beskrivelse av brutto morfologi av et anlegg etter samspill 16,17. En annen typisk indirekte indikator på A. thaliana mottakelighet for et skadedyr er en tørr eller våt vekt vurdering av planteeter. Denne parameteren er ofte brukt for å karakterisere herbivory av lepidoterans, slik som Pieris rapae (liten hvit), P. xylostella, eller T. ni på larve eller pupal iscenesetter 15,17.

Spider midd er celle-innhold feEders. Mite-indusert skade er anerkjent som en samling av chlorotic flekker som varierer i farge fra hvit til blek grønn. Mottakelighet av et anlegg vert å edderkopp midd herbivory ble tidligere vurdert enten indirekte gjennom analyse av edderkoppen midd ytelses dager etter infisering 18,19, eller direkte ved hjelp av brutto morfologi av planter uker etter infeksjons 18 eller ved hjelp av en digital avbildning av blader utsatt mot midd i flere dager med påfølgende automatisert bildeanalyse 19. Disse metodene ble utviklet og brukt for studier av interaksjoner mellom tomatplanter og T. urticae, og vanligvis brukt lite antall edderkopp midd (5-15 per behandling) som ble samlet inn fra den blandede midd befolkning og ble plassert på bladet overflaten med en myk børste. Men disse fremgangsmåter er ikke egnet for studier hvor større antall midd må anvendes. I tillegg, mens direkte behandling av blad-bilder i bildeanalyse-programvaresom Adobe Photoshop (San Jose, CA), eller ImageJ 20 kan anvendes for analyse av tomat skade disse protokollene trenger modifikasjon for å kunne anvendes på blader som har større grad av refleksjon av overflaten eller blir lett farget, og har svært synlige trichomes ( f.eks, A. thaliana) som forstyrrer automatisert utvalg av chlorotic flekker som preger anlegget skader. Videre er det utviklingsmessige stadiet av spindelmidd som lett kan benyttes med de tidligere fremgangsmåter er begrenset til de mest utbredte og lett identifiserbare voksne hunner, og utelukker bruken av andre utviklingsstadier.

Den første avgjørende skritt mot high-throughput analyser av plante-edderkopp midd samhandling er å etablere reproduserbare, enkle og robuste protokoller for å utfordre planter med edderkopp midd og pålitelig vurdere interaksjons utfall.

I denne videoen, en effektiv metode for rask og enkel samling av et stort number av voksne hunnmidd, er deres applikasjon på en eksperimentell anlegget vert, og vurderingen av anlegget skade på grunn av edderkopp midd fôring beskrevet. Den presenterte protokollen muliggjør rask og effektiv innsamling av hundrevis av personer på ethvert utviklingsstadiet (egg, larver, nymfer, voksne menn, og kvinner) som kan benyttes til senere eksperimentelt program. I tillegg kan disse protokoller brukes på alle midd vertsplanten, men er spesielt vist i tilfellet A. thaliana.

Protocol

En. Vedlikehold av Spider Mite Befolkning MERK: Spider midd er alet opp på California røde kidneybønner (Phaseolus vulgaris). Grow bønne planter fra frø i 2-3 uker før angrepet. Intermix disse plantene med infiserte planter; voksen midd vil raskt kolonisere friskt plantemateriale. Fjern gamle infested bønne planter hver 7-10 dager, og erstatte dem med friske planter. To. Samle Voksen Kvinne Midd Mite…

Representative Results

Ved hjelp av 20 til 30 infiserte bønneplanter, kan man samle rundt 2000 voksen hunnmidd hjelp sikter. Den tiden som kreves for å hjemsøke 10 planter med 20 midd per plante er ca 15 min hvis du bruker en pensel til å overføre midd. Kombinasjoner av innsamlings-og påføringsmetoder er vist i figur 2.. Denne protokollen genererer reproduserbare resultater av anlegget skade, viser at innsamlede midd er av tilsvarende fysiologiske tilstand og egnet for plante-edderkopp midd…

Discussion

Denne videoen viser protokollene som brukes til å isolere og å hjemsøke planter med et stort antall voksne kvinnelige midd. Selv om vi presenterte denne protokollen med A. thaliana, kan det brukes til noe plante-edderkopp midd interaksjon system og blir nå med hell brukes også på tomat og Grapevine (Vitis vinifera) planter. Protokollen rentene reproduserbare resultater, indikerer at innsamlede midd er av sammenlignbare fysiologiske tilstand (figur 3).

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).

Materials

Plant material:
California red kidney bean Stokes, Thorold, ON, Canada NA Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used.
Chemicals:
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting
Tap water Any supplier NA At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance
Other materials and equipment:
Plastic tray Any supplier NA
Set of scissors Any supplier NA
2 L beakers Any supplier NA
Paper towels Any supplier NA
Sets of sieves Manufactured in house NA Detailed instructions are available
Thin brush Any supplier NA
Pipettes Any supplier NA
Pipette tips Any supplier NA 0.2 and 1 mL
1.5 mL centrifuge tubes Any supplier NA
Air pump Any supplier NA Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi
Stereoscope Any supplier NA
Scanner Epson V30 Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments.
Computer Any supplier NA Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software.
Adobe Photoshop software Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA various Any version with Histogram tool included.

Referências

  1. Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. . Mites injurious to economic plants. , (1975).
  2. Migeon, A., Dorkeld, F. Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae. http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).
  3. Croft, B. A., Vandebaan, H. E. Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites. Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).
  4. Van Leeuwen, T., et al. Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).
  5. Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review. Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).
  6. Dermauw, W., et al. The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance. Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).
  7. Van Leeuwen, T., et al. Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).
  8. Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Development. 129, 5461-5472 (2002).
  9. Khila, A., Grbic, M. Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene. Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).
  10. Grbic, M., et al. Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).
  11. Grbic, M., et al. The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations. Nature. 479, 487-492 (2011).
  12. Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana. Genética. 161, 325-332 (2002).
  13. Abe, H., et al. Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding. Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).
  14. Whiteman, N. K., et al. Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis. Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).
  15. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).
  16. Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid). The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).
  17. Adio, A. M., et al. Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite. Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).
  18. Li, L., et al. The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development. Plant Cell. 16, 126-143 (2004).
  19. Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants. Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
check_url/pt/51738?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Cazaux, M., Navarro, M., Bruinsma, K. A., Zhurov, V., Negrave, T., Van Leeuwen, T., Grbic, V., Grbic, M. Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies. J. Vis. Exp. (89), e51738, doi:10.3791/51738 (2014).

View Video