Protokoller for effektiv utarbeidelse av homogene prøver av edderkopp midd, angrep av eksperimentelle planter, og vurdering av anlegget skader, slik det kreves for studier av plante-pest interaksjon ble utviklet.
De to-spotted spider mite, Tetranychus urticae, er en allestedsnærværende polyphagous leddyr herbivore som strømmer på en bemerkelsesverdig bredt spekter av arter, med mer enn 150 av økonomisk verdi. Det er en stor pest av klima avlinger, spesielt i solanaceae og Cucurbitaceae (f.eks, tomater, auberginer, paprika, agurk, squash) og klimapryd (f.eks, roser, krysantemum, nelliker), årlige jordbruksvekster (som mais, bomull, soyabønner, og sukkerroer), og i flerårige kulturer (alfalfa, jordbær, druer, sitrus og plommer) 1,2. I tillegg til det ytterste polyphagy som gjør det til et viktig landbruks pest, T. urticae har en tendens til å utvikle resistens mot et bredt utvalg av insekticider og acaricider som benyttes for sin styring 3-7.
T. urticae er en utmerket eksperimentell organisme, som det har en hurtig livssyklus (7 dager ved 27 ° C), og kan lett opprettholdes ved høy tetthet i laboratoriet. Metoder for å bestemme genekspresjon (inkludert in situ hybridisering og antistoffarging), og for å inaktivere ekspresjon av edderkoppmidd endogene gener ved hjelp av RNA-interferens er blitt utviklet 8-10. Nylig har hele genomsekvens av T. urticae har blitt rapportert, og skaper en mulighet til å utvikle denne pest herbivore som modellorganisme med tilsvarende genomisk ressurser som allerede finnes i noen av sine vertsplanter (Arabidopsis thaliana og tomat Solanum Lycopersicum) 11. Sammen kan disse modellorganismer gi innsikt i molekylære grunnlaget for plantevern interaksjoner.
Her er en effektiv metode for rask og enkel samling av et stort antall voksne hunnmidd, deres anvendelse på en eksperimentell plante-vert, og vurderingen av anlegget skade på grunn av spider mite foring beskrevet. Den presenterte protokollen noringen er rask og effektiv innsamling av hundrevis av personer på ethvert utviklingsstadiet (egg, larver, nymfer, voksne menn, og kvinner) som kan benyttes til senere eksperimentelt program.
Plant-pest interaksjon er et tema av stor vitenskapelig og økonomisk betydning. Det var historisk studert ved hjelp av både planter (for eksempel tomat) og modell anlegg, A. thaliana. I begge tilfeller kunne mottakelighet for anlegget til planteeter måles enten direkte gjennom vurdering av plante fenotype etter herbivore angrep eller indirekte ved vurderingen av pest ytelse.
Direkte målinger av plante mottakelighet ble benyttet tidligere for et antall insekt skadedyr ved hjelp av en rekke metoder. For eksempel er herbivory av lepidopteran-larver målt som en estimering av det parti av plantevev som forbrukes av enten Plutella xylostella (diamant møll) eller Trichoplusia ni (kål sløyfen) ved det blotte øye ved hjelp av et gitter 12.. Også, det finnes metoder som utnytter digital avbildning av blad skade med påfølgende kvantitativ bildeanalyse. Slike fremgangsmåter ble brukt istudier av A. thaliana interaksjon med Frankliniella occidentalis (vestlige blomst thrips) 13, Scaptomyza flava (blad-mining Drosophila) 14, og T. ni 15.
Indirekte målinger av plante mottakelighet er mye brukt i studier av plante-pest interaksjon. For eksempel susceptibility of A. thaliana å fersken bladlus Myzus persicae herbivory er vanligvis vurderes gjennom analyse av pest fruktbarhet og beskrivelse av brutto morfologi av et anlegg etter samspill 16,17. En annen typisk indirekte indikator på A. thaliana mottakelighet for et skadedyr er en tørr eller våt vekt vurdering av planteeter. Denne parameteren er ofte brukt for å karakterisere herbivory av lepidoterans, slik som Pieris rapae (liten hvit), P. xylostella, eller T. ni på larve eller pupal iscenesetter 15,17.
Spider midd er celle-innhold feEders. Mite-indusert skade er anerkjent som en samling av chlorotic flekker som varierer i farge fra hvit til blek grønn. Mottakelighet av et anlegg vert å edderkopp midd herbivory ble tidligere vurdert enten indirekte gjennom analyse av edderkoppen midd ytelses dager etter infisering 18,19, eller direkte ved hjelp av brutto morfologi av planter uker etter infeksjons 18 eller ved hjelp av en digital avbildning av blader utsatt mot midd i flere dager med påfølgende automatisert bildeanalyse 19. Disse metodene ble utviklet og brukt for studier av interaksjoner mellom tomatplanter og T. urticae, og vanligvis brukt lite antall edderkopp midd (5-15 per behandling) som ble samlet inn fra den blandede midd befolkning og ble plassert på bladet overflaten med en myk børste. Men disse fremgangsmåter er ikke egnet for studier hvor større antall midd må anvendes. I tillegg, mens direkte behandling av blad-bilder i bildeanalyse-programvaresom Adobe Photoshop (San Jose, CA), eller ImageJ 20 kan anvendes for analyse av tomat skade disse protokollene trenger modifikasjon for å kunne anvendes på blader som har større grad av refleksjon av overflaten eller blir lett farget, og har svært synlige trichomes ( f.eks, A. thaliana) som forstyrrer automatisert utvalg av chlorotic flekker som preger anlegget skader. Videre er det utviklingsmessige stadiet av spindelmidd som lett kan benyttes med de tidligere fremgangsmåter er begrenset til de mest utbredte og lett identifiserbare voksne hunner, og utelukker bruken av andre utviklingsstadier.
Den første avgjørende skritt mot high-throughput analyser av plante-edderkopp midd samhandling er å etablere reproduserbare, enkle og robuste protokoller for å utfordre planter med edderkopp midd og pålitelig vurdere interaksjons utfall.
I denne videoen, en effektiv metode for rask og enkel samling av et stort number av voksne hunnmidd, er deres applikasjon på en eksperimentell anlegget vert, og vurderingen av anlegget skade på grunn av edderkopp midd fôring beskrevet. Den presenterte protokollen muliggjør rask og effektiv innsamling av hundrevis av personer på ethvert utviklingsstadiet (egg, larver, nymfer, voksne menn, og kvinner) som kan benyttes til senere eksperimentelt program. I tillegg kan disse protokoller brukes på alle midd vertsplanten, men er spesielt vist i tilfellet A. thaliana.
Denne videoen viser protokollene som brukes til å isolere og å hjemsøke planter med et stort antall voksne kvinnelige midd. Selv om vi presenterte denne protokollen med A. thaliana, kan det brukes til noe plante-edderkopp midd interaksjon system og blir nå med hell brukes også på tomat og Grapevine (Vitis vinifera) planter. Protokollen rentene reproduserbare resultater, indikerer at innsamlede midd er av sammenlignbare fysiologiske tilstand (figur 3).
…
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).
Plant material: | |||
California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | NA | Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. |
Chemicals: | |||
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
Tap water | Any supplier | NA | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance |
Other materials and equipment: | |||
Plastic tray | Any supplier | NA | – |
Set of scissors | Any supplier | NA | – |
2 L beakers | Any supplier | NA | – |
Paper towels | Any supplier | NA | – |
Sets of sieves | Manufactured in house | NA | Detailed instructions are available |
Thin brush | Any supplier | NA | – |
Pipettes | Any supplier | NA | – |
Pipette tips | Any supplier | NA | 0.2 and 1 mL |
1.5 mL centrifuge tubes | Any supplier | NA | – |
Air pump | Any supplier | NA | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi |
Stereoscope | Any supplier | NA | – |
Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
Computer | Any supplier | NA | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. |
Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |