Applicazione di due-macchiato Spider Mite<em> Tetranychus urticae</em> Per gli Studi Plant-parassita di interazione
Summary
Protocolli per la preparazione efficiente di campioni omogenei di acari, infestazione di piante sperimentali, e la valutazione del danno dell'impianto, come richiesto per gli studi di interazione pianta-parassita sono stati sviluppati.
Abstract
Il ragnetto due maculato, Tetranychus urticae, è un onnipresente erbivoro artropode polifago che si nutre di una notevole vasta gamma di specie, con più di 150 di valore economico. Si tratta di un parassita importante di colture in serra, specialmente in Solanacee e Cucurbitacee (ad esempio, pomodori, melanzane, peperoni, cetrioli, zucchine) e ornamentali serra (ad esempio, rose, crisantemi, garofani), colture annuali di campo (come il mais, cotone, soia e barbabietola da zucchero), e in colture perenni (erba medica, fragole, uva, agrumi, e susine) 1,2. Oltre al polyphagy estremo che rende un importante parassiti agricoli, T. urticae ha una tendenza a sviluppare resistenza ad una vasta gamma di insetticidi e acaricidi che sono usati per il suo controllo 3-7.
T. urticae è un ottimo organismo sperimentale, in quanto ha un ciclo vitale rapido (7 giorni a 27 ° C)e può essere facilmente mantenuta ad alta densità in laboratorio. Metodi per saggiare l'espressione genica (compresi ibridazione in situ e colorazione degli anticorpi) e per inattivare l'espressione del ragnetto geni endogeni utilizzando RNA interference sono stati sviluppati 8-10. Recentemente, l'intera sequenza del genoma di T. urticae è stata riportata, creando l'opportunità di sviluppare questo parassita erbivoro come organismo modello con risorse genomiche equivalenti che già esistono in alcune delle sue piante ospiti (Arabidopsis thaliana e il pomodoro Solanum lycopersicum) 11. Insieme, questi organismi modello potrebbero fornire approfondimenti basi molecolari delle interazioni pianta-parassiti.
Qui, un metodo efficiente per la raccolta rapida e semplice di un gran numero di acari femmina adulta, la loro applicazione su un host impianto sperimentale, e la valutazione del danno pianta causa alimentazione ragnetto sono descritti. Il protocollo presentato enAbles raccolta veloce ed efficiente di centinaia di persone, in qualsiasi stadio di sviluppo (uova, larve, ninfe, maschi adulti e femmine) che può essere utilizzata per la successiva applicazione sperimentale.
Introduction
Interazione pianta-parassita è un argomento di grande importanza scientifica ed economica. È stato storicamente studiata utilizzando entrambe le piante coltivate (come pomodoro) e pianta modello, A. thaliana. In entrambi i casi, la suscettibilità della pianta erbivoro potrebbe essere misurata sia direttamente attraverso la valutazione degli impianti fenotipo dopo l'attacco di erbivori o indirettamente attraverso la valutazione delle prestazioni dei parassiti.
Misure dirette di pianta suscettibilità sono stati utilizzati precedentemente per un certo numero di specie di parassiti utilizzando una serie di metodi. Ad esempio, herbivory di larve di lepidotteri è misurato come una stima della porzione di tessuto vegetale consumata da uno Plutella xylostella (diamondback falena) o Trichoplusia ni (cavolo looper) ad occhio nudo con l'aiuto di una griglia 12. Inoltre, ci sono metodi che utilizzano l'imaging digitale di danni foglia con successiva analisi quantitativa delle immagini. Tali metodi sono stati usati instudi di A. interazione thaliana con Frankliniella occidentalis (tripidi fiore occidentali) 13, Scaptomyza flava (foglia-mining drosophila) 14, e T. ni 15.
Misure indirette di piante suscettibilità sono ampiamente utilizzati negli studi di interazione pianta-parassita. Ad esempio, suscettibilità di A. thaliana Peach afide Myzus persicae erbivori in genere viene valutata attraverso l'analisi dei parassiti fecondità e la descrizione della morfologia lorda di un impianto dopo l'interazione 16,17. Un altro tipico indicatore indiretto di A. thaliana suscettibilità a un parassita è una valutazione del peso secco o umido del erbivoro. Questo parametro è comunemente utilizzato per caratterizzare erbivori di lepidoterans, come Pieris rapae (piccolo bianco), P. xylostella, o T. ni al loro larve o pupe stadi 15,17.
Acari sono cellule-content feeders. Mite danno indotto è riconosciuto come un insieme di macchie clorotiche che variano di colore dal bianco al verde pallido. La suscettibilità di una pianta ospite per ragnetto erbivori è stato precedentemente valutato sia indirettamente attraverso l'analisi dei giorni di spettacolo ragnetto post-infestazione 18,19, o direttamente con morfologia lordo delle piante settimane post-infestazione 18 o utilizzando un imaging digitale di foglie esposte agli acari per giorni con successiva analisi delle immagini automatizzata 19. Questi metodi sono stati sviluppati e utilizzati per lo studio di interazioni tra piante di pomodoro e T. urticae, e in genere utilizzato un piccolo numero di acari (5-15 al trattamento) che sono stati raccolti dalla popolazione di acari mista e sono stati collocati sulla superficie del foglio con una spazzola a setole morbide. Tuttavia, questi metodi non sono adatti per studi in cui devono essere applicate maggior numero di acari. Inoltre, durante l'elaborazione diretta delle immagini foglia in software di analisi dell'immaginecome Adobe Photoshop (San Jose, CA) o ImageJ 20 possono essere utilizzate per l'analisi di danni pomodoro, questi protocolli devono essere modificate in modo da applicare a foglie che hanno una maggiore riflettività della superficie o sono leggermente colorate e hanno tricomi altamente visibili ( ad esempio, A. thaliana) che interferiscono con la selezione automatica delle macchie clorotiche che segnano danni pianta. Inoltre, lo stadio di sviluppo di acari che possono essere facilmente utilizzati con i metodi precedenti si limita alle femmine adulte più diffusi e facilmente identificabili ed esclude l'utilizzo di altri stadi di sviluppo.
Il primo passo fondamentale verso l'analisi high-throughput di interazione acari pianta ragno è di stabilire, protocolli semplici e robuste riproducibili a sfidare le piante con acari e affidabile valutare i risultati di interazione.
In questo video, un metodo efficiente per la raccolta rapida e semplice di un grande numeroro di acari adulti di sesso femminile, la loro applicazione su un host impianto sperimentale, e la valutazione dei danni dell'impianto a causa di alimentazione ragnetto sono descritti. Il protocollo presentato consente la raccolta veloce ed efficiente di centinaia di persone, in qualsiasi stadio di sviluppo (uova, larve, ninfe, maschi adulti e femmine) che può essere utilizzata per la successiva applicazione sperimentale. Inoltre, questi protocolli possono essere applicati a qualsiasi pianta ospite acari, ma sono specificamente dimostrato nel caso di A. thaliana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo video dimostra protocolli utilizzati per isolare e ad infestare le piante con un gran numero di acari adulti di sesso femminile. Anche se abbiamo presentato questo protocollo usando A. thaliana, può essere usato per qualsiasi sistema di interazione acaro pianta-ragno e viene attualmente applicato con successo anche su piante di pomodoro e vite (Vitis vinifera). I rendimenti protocollo risultati riproducibili, indicando che gli acari raccolti sono stato fisiologico paragonabile (Figura 3…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).
Materials
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | NA | Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | Any supplier | NA | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance |
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | Any supplier | NA | – |
| Set of scissors | Any supplier | NA | – |
| 2 L beakers | Any supplier | NA | – |
| Paper towels | Any supplier | NA | – |
| Sets of sieves | Manufactured in house | NA | Detailed instructions are available |
| Thin brush | Any supplier | NA | – |
| Pipettes | Any supplier | NA | – |
| Pipette tips | Any supplier | NA | 0.2 and 1 mL |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Any supplier | NA | – |
| Air pump | Any supplier | NA | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi |
| Stereoscope | Any supplier | NA | – |
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Any supplier | NA | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. |
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
Referências
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