Summary

יישום של קרדית העכביש הבחין-Two<em> Tetranychus urticae</em> לאינטראקצית צמח-מזיקים ללימודים

Published: July 04, 2014
doi:

Summary

פרוטוקולים להכנה יעילה של דגימות אחידות של קרדית עכביש, התפשטות של צמחים ניסיוניים, והערכה של נזק צמח, כפי שנדרש למחקרים של אינטראקציה בין צמחים למזיקים פותחו.

Abstract

קרדית העכביש שני המנומרת, Tetranychus urticae, הוא אוכלי עשב arthropod polyphagous בכל מקום שייזון ממגוון רחב להפליא של מינים, עם יותר מ 150 של ערך כלכלי. זה מזיקים עיקריים של גידולים בחממות, בעיקר בהסולניים ודלועיים (למשל, עגבניות, חצילים, פלפלים, מלפפונים, קישואים) ונוי חממה (למשל, ורדים, חרציות, ציפורנים), גידולי שדה שנתי (כגון תירס, כותנה, סויה, וסלק סוכר), ובתרבויות רב שנתית (אספסת, תותים, ענבים, הדרים, ושזיפים) 1,2. בנוסף לpolyphagy הקיצוני שהופך אותו למזיק חקלאי חשוב, ט יש urticae נטייה לפתח עמידות למגוון רחב של חומרי הדברה וacaricides המשמשים לשליטתה 3-7.

ט urticae הוא אורגניזם ניסיוני מצוין, שכן יש מחזור חיים מהיר (7 ימים ב27 ° C)ויכול להישמר בקלות בצפיפות גבוהה במעבדה. שיטות לassay ביטוי גנים (כולל הכלאה באתרו ומכתים נוגדן) וכדי להשבית את הביטוי של גנים אנדוגניים קרדית עכביש באמצעות התערבות RNA פותחו 8-10. לאחרונה, כל רצף הגנום של ט ' urticae כבר דיווח, יצירת הזדמנות לפתח אוכלי עשב המזיק הזה כאורגניזם מודל עם משאבי גנומי מקבילים שכבר קיימים בחלק ממפעליה מארח (thaliana ארבידופסיס וlycopersicum Solanum העגבניות) 11. יחד, אורגניזמים מודל אלה יכולים לספק תובנות לתוך בסיסים מולקולריים של אינטראקציות בין צמחים למזיקים.

הנה, שיטה יעילה לאיסוף מהיר וקל של מספר גדול של קרדית נקבה הבוגרת, היישום שלהם על מארח מפעל ניסיוני, וההערכה של נזק הצמח בשל האכלת קרדית עכביש מתוארות. הפרוטוקול המובא enables אוסף מהיר ויעיל של מאות אנשים בכל שלב התפתחותי (ביצים, זחלים, נימפות, זכרים בוגרים, ונשים) שיכול לשמש ליישום ניסיוני שלאחר מכן.

Introduction

אינטראקציה בין צמחים למזיקים היא נושא בעל חשיבות מדעית וכלכלית גדולה. זה מבחינה היסטורית נחקר באמצעות שני צמחי היבול (כגון עגבניות) וצמח המודל, א ' thaliana. בשני המקרים, רגישות של צמח לאוכלי עשב ניתן הייתה למדוד באופן ישיר דרך הערכה של פנוטיפ צמח לאחר התקף אוכלי עשב או בעקיפין באמצעות ההערכה של ביצועי מזיקים.

מדידה ישירה של רגישות צמח נוצלו בעבר למספר מיני חרקים מזיקים באמצעות מגוון של שיטות. לדוגמא, herbivory של זחלי lepidopteran נמדד כהערכה של החלק מרקמות צמח שנצרכו על ידי שתי xylostella Plutella (עש Diamondback) או Trichoplusia ni (Looper כרוב) בעין בלתי מזוינת בעזרת רשת 12. כמו כן, ישנן שיטות שעושות שימוש בהדמיה דיגיטלית של נזק עלה עם ניתוח תמונת כמותית שלאחר מכן. שיטות כאלה היו בשימוש במחקריו של א ' אינטראקציה thaliana עם Frankliniella occidentalis (תריפס פרחים המערבי) 13, flava Scaptomyza (דרוזופילה כריית עלים) 14, וט ni 15.

מדידות עקיפות של רגישות צמח נמצאות בשימוש נרחב במחקרים של אינטראקציה בין צמחים למזיקים. לדוגמא, רגישות של א ' thaliana לאפרסק Myzus כנימת persicae herbivory נבחנים בדרך כלל באמצעות ניתוח של פוריות מזיקים ותיאור של מורפולוגיה ברוטו של צמח אחרי האינטראקציה 16,17. עוד אינדיקטור עקיף טיפוסי של א ' רגישות thaliana למזיקים היא הערכת משקל יבשה או רטובה של אוכלי העשב. פרמטר זה משמש בדרך כלל כדי לאפיין תזונה צמחונית של lepidoterans, כגון פיאריס ראפא (לבן קטן), פ xylostella, או ט ני בזחל או גלמים שלהם בשלבי 15,17.

קרדית עכביש תא התוכן Feeders. נזק הנגרם לקרדית מוכר כאוסף של כתמי chlorotic שטווח צבע לבן חיוורים ירוק. הרגישות של מארח מפעל לherbivory קרדית העכביש הוערכה או בעקיפין בעבר באמצעות הניתוח של ימי ביצועי קרדית עכביש לאחר שריצה-18,19, או ישירות באמצעות מורפולוגיה ברוטו של שבועות צמחים שלאחר שריצה 18 או באמצעות הדמיה דיגיטלית של עלים חשופים לקרדית במשך ימים עם ניתוח תמונה אוטומטי לאחר 19. שיטות אלה היו מפותחות ומשמשות למחקרים של אינטראקציות בין צמחי עגבניות וט urticae, ומשמש בדרך כלל מספר הקטן של קרדית עכביש (5-15 לכל טיפול), שנגבו מאוכלוסיית קרדית המעורבת והונחו על פני העלה בעזרת מברשת זיפים רכה. עם זאת, שיטות אלו אינן מתאימות למחקרים שבם מספר גדול יותר של קרדית צריך להיות מיושם. בנוסף, בעוד שעיבוד ישיר של תמונות עלה בתוכנת ניתוח תמונהכגון Adobe Photoshop (סן חוזה, קליפורניה) או 20 ImageJ יכולה לשמש לניתוח של נזק עגבניות, הפרוטוקולים האלה צריכים שינוי כדי להיות מיושמים על עלים שיש לי רפלקטיביות גדולה יותר של פני השטח או נצבעים באורח קל ויש לי trichomes הבולט מאוד ( למשל, thaliana א ') שמפריעים לבחירה אוטומטית של נקודות chlorotic המציינות נזק צמח. יתר על כן, השלב ההתפתחותי של קרדית עכביש שיכול להיות מנוצל בקלות עם השיטות הקודמות מוגבל לנשים בוגרות והנפוצות ביותר לזיהוי בקלות ומונע ניצול של שלבי התפתחות אחרים.

הצעד הקריטי הראשון לקראת ניתוח תפוקה גבוהה של אינטראקציה קרדית צמחים עכביש הוא להקים פרוטוקולים לשחזור, פשוט וחזקים לאתגר את צמחים עם קרדית עכביש ואמין להעריך את תוצאות אינטראקציה.

בסרטון הזה, שיטה יעילה לאיסוף מהיר וקל של num גדולבער של קרדית נקבה בוגרת, היישום שלהם על מארח ניסיוני צמח, וההערכה של נזק הצמח בשל האכלת קרדית עכביש מתוארים. הפרוטוקול המובא מאפשר איסוף מהיר ויעיל של מאות אנשים בכל שלב התפתחותי (ביצים, זחלים, נימפות, זכרים בוגרים, ונשים) שיכול לשמש ליישום ניסיוני שלאחר מכן. בנוסף, ניתן ליישם פרוטוקולים אלה לכל צמח מארח קרדית, אבל באופן ספציפי הוכיחו במקרה של א ' thaliana.

Protocol

1. תחזוקה של עכביש קרדית האוכלוסייה הערה: קרדית עכביש שגדל על קליפורניה כליה אדומה שעועית (Phaseolus vulgaris). לגדל צמחי שעועית מזרעים ל2-3 שבועות לפני שריצה. <li style=";text-align:right;direction:rtl"…

Representative Results

שימוש 20-30 צמחי שעועית שורצים, אחד יכול לאסוף סביב 2,000 קרדית נקבה בוגרת באמצעות הנפות. הזמן הנדרש לשורץ 10 צמחים עם 20 קרדית לכל צמח הוא כ 15 דקות אם בעזרת מברשת להעביר קרדית. שילובים של שיטות איסוף ויישום מוצגים באיור 2. פרוטוק…

Discussion

וידאו זה מדגים פרוטוקולים משמשים כדי לבודד ושורצים צמחים עם מספר גדול של קרדית נקבה הבוגרת. למרות שהצגנו בפני פרוטוקול זה באמצעות א thaliana, ניתן להשתמש בו לכל מערכת אינטראקציה קרדית צמחים עכביש וכיום הוא מיושם בהצלחה גם על צמחי עגבניות וגפן (vinifera ויטיס). תשואו…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).

Materials

Plant material:
California red kidney bean Stokes, Thorold, ON, Canada NA Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used.
Chemicals:
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting
Tap water Any supplier NA At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance
Other materials and equipment:
Plastic tray Any supplier NA
Set of scissors Any supplier NA
2 L beakers Any supplier NA
Paper towels Any supplier NA
Sets of sieves Manufactured in house NA Detailed instructions are available
Thin brush Any supplier NA
Pipettes Any supplier NA
Pipette tips Any supplier NA 0.2 and 1 mL
1.5 mL centrifuge tubes Any supplier NA
Air pump Any supplier NA Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi
Stereoscope Any supplier NA
Scanner Epson V30 Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments.
Computer Any supplier NA Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software.
Adobe Photoshop software Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA various Any version with Histogram tool included.

Referências

  1. Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. . Mites injurious to economic plants. , (1975).
  2. Migeon, A., Dorkeld, F. Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae. http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).
  3. Croft, B. A., Vandebaan, H. E. Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites. Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).
  4. Van Leeuwen, T., et al. Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).
  5. Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review. Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).
  6. Dermauw, W., et al. The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance. Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).
  7. Van Leeuwen, T., et al. Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).
  8. Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Development. 129, 5461-5472 (2002).
  9. Khila, A., Grbic, M. Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene. Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).
  10. Grbic, M., et al. Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).
  11. Grbic, M., et al. The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations. Nature. 479, 487-492 (2011).
  12. Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana. Genética. 161, 325-332 (2002).
  13. Abe, H., et al. Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding. Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).
  14. Whiteman, N. K., et al. Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis. Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).
  15. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).
  16. Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid). The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).
  17. Adio, A. M., et al. Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite. Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).
  18. Li, L., et al. The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development. Plant Cell. 16, 126-143 (2004).
  19. Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants. Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
check_url/pt/51738?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Cazaux, M., Navarro, M., Bruinsma, K. A., Zhurov, V., Negrave, T., Van Leeuwen, T., Grbic, V., Grbic, M. Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies. J. Vis. Exp. (89), e51738, doi:10.3791/51738 (2014).

View Video