Die Anwendung der Zwei-Spinnmilbe<em> Tetranychus urticae</em> Für Plant-Schädlingsinteraction Studies
Summary
Protokolle für die effiziente Herstellung von homogenen Proben von Spinnmilben, Befall der Versuchspflanzen und Bewertung von Pflanzenschäden, wie für Studien der Pflanzenschädlingseingriff erforderlich entwickelt.
Abstract
Die beiden Spinnmilbe, Tetranychus urticae, ist ein allgegenwärtiges polyphagen Arthropoden Pflanzenfresser, die auf einem bemerkenswert breites Spektrum von Arten, mit mehr als 150 von wirtschaftlichem Wert-Feeds. Es ist eine große Pest von Gewächshauskulturen, insbesondere in der Nachtschattengewächse und Kürbisgewächse (zB Tomaten, Auberginen, Paprika, Gurken, Zucchini) und Gewächshaus Zierpflanzen (zB Rosen, Chrysanthemen, Nelken), jährliche Feldfrüchte (wie Mais, Baumwolle, Sojabohne und Zuckerrübe) und in Dauerkulturen (Alfalfa, Erdbeeren, Trauben, Zitrusfrüchte und Pflaumen) 1,2. Neben der extremen polyphagy, dass es ein wichtiger landwirtschaftlicher Schädling, T. macht urticae eine Tendenz hat, Resistenz gegen ein breites Spektrum von Insektizide und Akarizide, die für dessen Steuerung verwendet werden 3-7 entwickeln.
T. urticae eine ausgezeichnete Versuchsorganismus, da es eine schnelle Lebensdauer (7 Tage bei 27 ° C)und kann leicht in hoher Dichte im Labor gehalten werden. Methoden zur Gen-Expression (einschließlich in-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung) zu untersuchen und um die Expression der Spinnmilbe endogenen Genen mittels RNA-Interferenz zu inaktivieren entwickelt worden 8-10. Vor kurzem hat die gesamte Genomsequenz von T. urticae wurde berichtet, die Schaffung einer Möglichkeit, diesen Schädling Pflanzenfresser als Modellorganismus mit gleichwertigen genomische Ressourcen, die bereits in einigen seiner Wirtspflanzen (Arabidopsis thaliana und die Tomate Solanum lycopersicum) 11 existieren zu entwickeln. Zusammen könnten diese Modellorganismen Einblicke in die molekularen Grundlagen der Pflanzenschädlings Interaktionen bieten.
Hier eine effiziente Methode zur schnellen und einfachen Sammlung von einer großen Anzahl von erwachsenen weiblichen Milben, deren Anwendung auf einer Versuchsanlage Wirt, und die Bewertung der Anlage Schäden durch Spinnmilbe Fütterung beschrieben. Das vorgestellte Protokoll enmöglicht eine schnelle und effiziente Sammlung von Hunderten von Personen zu jedem beliebigen Entwicklungsstufe (Eier, Larven, Nymphen, erwachsene Männer und Frauen), die für die nachfolgende experimentelle Anwendung verwendet werden kann.
Introduction
Plant-Schädling Interaktion ist ein Thema von großer wissenschaftlicher und wirtschaftlicher Bedeutung. Es wurde historisch mit beiden Kulturpflanzen (wie Tomate) und der Modellpflanze, A. studierte thaliana. In beiden Fällen ist die Anfälligkeit der Anlagen an den Pflanzenfresser könnten entweder direkt durch die Bewertung von Pflanzen Phänotyp nach Herbivorbefall oder indirekt über die Bewertung der Schädling Leistung gemessen werden.
Direkte Messungen der Suszeptibilität Pflanze zuvor für eine Anzahl von Insektenschädlingsarten unter Verwendung einer Reihe von Verfahren verwendet. Zum Beispiel wird der Fraßschmetterlingslarven als eine Schätzung des Teils von entweder Plutella xylostella (Kohlschabe) oder Trichoplusia ni (Kohlspannerraupe), die durch das bloße Auge mit Hilfe eines Gitters 12 verbrauchten Pflanzengewebe gemessen. Auch gibt es Verfahren, die digitale Bildgebung von Blattschäden mit anschließender quantitativer Bildanalyse zu verwenden. Solche Verfahren wurden verwendet,Untersuchungen von A. thaliana Interaktion mit Frankliniella occidentalis (westliche Blütenthrips) 13, Scaptomyza flava (blattminierenden Drosophila) 14 und T. ni 15.
Indirekte Messungen von Pflanzenanfälligkeit sind weit verbreitet in den Studien der Pflanzenschädlings Interaktion verwendet. Beispielsweise Empfindlichkeit von A. thaliana zu Blattlaus Myzus persicae Herbivorie Pfirsich wird in der Regel durch die Analyse von Schad Fruchtbarkeit und die Beschreibung des Brutto Morphologie einer Anlage nach der Wechselwirkung 16,17 bewertet. Ein weiteres typisches indirekter Indikator für A. thaliana Anfälligkeit für einen Schädling ein Trocken-oder Nassgewicht Beurteilung der Pflanzenfresser. Dieser Parameter wird üblicherweise verwendet, um Herbivorie von lepidoterans wie Pieris rapae (kleine weiße), P. charakterisieren xylostella oder T. ni an ihren Larven-oder Puppenstadien 15,17.
Spinnmilben sind Zellgehalt feEders. Mite-induzierte Schäden als eine Sammlung von chlorotische Flecken, die in der Farbe reichen von weiß bis hellgrün anerkannt. Die Suszeptibilität einer Wirtspflanze zu Spinnmilbenfraß wurde zuvor entweder indirekt durch die Analyse der Spinnmilbe Leistung Tagen bewertet Post-Befall 18,19 oder direkt mit grobe Morphologie der Pflanzen Wochen nach Befall 18 oder mit einem digitalen Bild der Blätter ausgesetzt für Tage mit anschließendem automatisierten Bildanalyse 19 Milben. Diese Verfahren wurden entwickelt und für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Tomatenpflanzen und T verwendet urticae, und in der Regel verwendet, eine kleine Anzahl von Spinnmilben (5-15 pro Behandlung), die aus der Mischmilbenpopulation erhoben wurden und mit einer weichen Bürste auf der Blattoberfläche platziert. Jedoch sind diese Verfahren nicht geeignet für Untersuchungen, bei denen eine größere Anzahl von Milben angewendet werden müssen. Darüber hinaus, während die direkte Verarbeitung von Blatt Bilder in der Bildanalyse-Softwarewie Adobe Photoshop (San Jose, CA) oder ImageJ 20 kann für die Analyse von Tomaten Schäden verwendet werden, müssen diese Protokolle Modifikation, um auf Blättern, die Reflektivität der Oberfläche mehr haben oder leicht gefärbt und haben gut sichtbare Trichome (angewendet werden zB A. thaliana), die mit automatisierten Auswahl von chlorotische Flecken, die Pflanzenschäden markieren stören. Ferner ist die Entwicklungsstufe des Spinnmilben, die leicht mit den früheren Verfahren verwendet werden können, um die am weitesten verbreitete und leicht identifizierbar erwachsenen Frauen beschränkt und schließt Verwendung anderer Entwicklungsstadien.
Der erste wichtige Schritt in Richtung Hochdurchsatz-Analyse von Pflanzen-Spinnmilbe Interaktion ist es, reproduzierbare, einfache und robuste Protokolle bauen, um Pflanzen mit Spinnmilben herausfordern und zuverlässig beurteilen Interaktion Ergebnisse.
In diesem Video eine effiziente Methode zur schnellen und einfachen Sammlung von einer großen number der erwachsenen weiblichen Milben, deren Anwendung auf einer Versuchsanlage Wirt, und die Bewertung der Anlage Schäden durch Spinnmilbe Fütterung beschrieben. Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die schnelle und effiziente Sammlung von Hunderten von Personen zu jedem beliebigen Entwicklungsstufe (Eier, Larven, Nymphen, erwachsene Männer und Frauen), die für die nachfolgende experimentelle Anwendung verwendet werden kann. Darüber hinaus können diese Protokolle einem Milbenwirtspflanze verwendet werden, sind aber insbesondere im Fall von A. nachgewiesen thaliana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Video zeigt Protokolle zur Isolierung und zu Pflanzen mit einer großen Anzahl von erwachsenen weiblichen Milben befallen. Obwohl wir präsentiert dieses Protokoll mit A. thaliana, kann es für jede Anlage-Spinnmilbe Interaktionssystem verwendet werden und wird derzeit erfolgreich auch auf Tomaten-und Wein (Vitis vinifera) Pflanzen aufgebracht. Die Protokoll liefert reproduzierbare Ergebnisse, was anzeigt, dass gesammelte Milben vergleichbarer physiologischen Zustand (Fig. 3). <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).
Materials
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | NA | Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | Any supplier | NA | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance |
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | Any supplier | NA | – |
| Set of scissors | Any supplier | NA | – |
| 2 L beakers | Any supplier | NA | – |
| Paper towels | Any supplier | NA | – |
| Sets of sieves | Manufactured in house | NA | Detailed instructions are available |
| Thin brush | Any supplier | NA | – |
| Pipettes | Any supplier | NA | – |
| Pipette tips | Any supplier | NA | 0.2 and 1 mL |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Any supplier | NA | – |
| Air pump | Any supplier | NA | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi |
| Stereoscope | Any supplier | NA | – |
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Any supplier | NA | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. |
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
Referências
- Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. . Mites injurious to economic plants. , (1975).
- Migeon, A., Dorkeld, F. Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae. http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).
- Croft, B. A., Vandebaan, H. E. Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites. Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).
- Van Leeuwen, T., et al. Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).
- Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review. Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).
- Dermauw, W., et al. The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance. Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).
- Van Leeuwen, T., et al. Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).
- Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Development. 129, 5461-5472 (2002).
- Khila, A., Grbic, M. Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene. Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).
- Grbic, M., et al. Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).
- Grbic, M., et al. The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations. Nature. 479, 487-492 (2011).
- Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana. Genética. 161, 325-332 (2002).
- Abe, H., et al. Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding. Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).
- Whiteman, N. K., et al. Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis. Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).
- Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).
- Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid). The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).
- Adio, A. M., et al. Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite. Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).
- Li, L., et al. The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development. Plant Cell. 16, 126-143 (2004).
- Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants. Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
