Summary

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

Published: September 30, 2014
doi:

Summary

Redes corticais são controlados por um conjunto de pequenos, mas diversificada de interneurónios inibitórios. Investigação funcional dos interneurônios, portanto, requer a gravação específica e rigorosa identificação. Descrito aqui é uma abordagem conjunta, envolvendo gravações de células inteiras de pares simples ou synaptically acoplados de neurônios com rotulagem intracelular, post-hoc Análise morfológica e imunocitoquímica.

Abstract

GABAérgicos interneurónios inibitórios desempenham um papel central em circuitos neuronais do cérebro. Interneurônios compreendem um pequeno subconjunto da população neuronal (10-20%), mas mostram um alto nível de heterogeneidade fisiológica, morfológica e neuroquímica, refletindo suas diversas funções. Portanto, a investigação de interneurônios fornece importantes insights sobre os princípios de organização e função dos circuitos neuronais. Isso, no entanto, requer uma abordagem fisiológica e neuroanatomical integrada para a seleção e identificação dos tipos interneuron individuais. Whole-cell patch-clamp gravação de fatias cerebrais agudos de animais transgénicos, que expressam proteínas fluorescentes sob os promotores de marcadores específicos de Interneuron, fornece um método eficiente para alvejar e electrofisiologicamente caracterizar as propriedades intrínsecas e sinápticos dos tipos Interneuron específicos. Combinado com marcação com corante intracelular, esta abordagem pode ser estendida com post-hoc moanálise rphological e imunocitoquímica, permitindo a identificação sistemática dos neurônios registrados. Estes métodos podem ser adaptados para atender uma ampla gama de questões científicas a respeito propriedades funcionais de diversos tipos de neurônios corticais.

Introduction

Circuitos neuronais do hipocampo têm sido objecto de intenso escrutínio, no que diz respeito a ambos anatomia e fisiologia, devido ao seu papel essencial na aprendizagem e na memória, bem como navegação espacial em humanos e roedores. De igual modo, o proeminente, mas simples organização laminar do hipocampo torna esta região um objecto preferido de estudos sobre as propriedades estruturais e funcionais das redes corticais.

Circuitos do hipocampo são constituídos por células excitatórias principais (> 80%) e um menor (10-20%), mas coorte altamente diversificada de interneurónios inibitórios 1-3. Interneurônios libertar ácido γ-aminobutírico (GABA) a partir dos seus terminais de axónios, que actua em receptores ionotrópicos rápido GABA A (GABAA Rs) e receptores de GABA B metabotrópicos lentas (Rs GABA B) 4. Estes mecanismos inibidores contrabalançar excitação e regular a excitabilidade de células principais, e, assim, otempo ir e padrão de descarga. No entanto, o GABA libertado interneurónios actua não só em células principais, mas também nos próprios 5,6 interneurónios. Receptores pré e pós-sinápticos mediar regulação por feedback e interações mútuas inibitórios entre os vários tipos de interneuron. Estes mecanismos inibitórios em redes interneuron se acredita serem fundamentais para a geração e formação de padrões de atividade da população, em especial as oscilações em diferentes freqüências 7.

De célula inteira gravação patch-clamp é um método bem estabelecido para o exame das propriedades intrínsecas e interações sinápticas de neurônios. No entanto, devido à grande diversidade de tipos de Interneuron, investigação de interneurónios inibitórios requer rigorosa identificação das células gravadas. Como tipos interneuron hipocampo são características distintas morfológicas e neuroquímicas expressão do marcador, anatômico combinado e imunocitoquímica eXAME pode fornecer um meio para determinar preciso 6,8,9 identidade interneuron.

No presente trabalho, descrevemos uma abordagem experimental em que de célula inteira gravações de patch-clamp de neurônios individuais ou pares synaptically acoplados são combinados com rotulagem intracelular, seguido pelo post-hoc análise morfológica e imunocitoquímica, permitindo a caracterização de lento GABA B mediada pelo receptor efeitos inibitórios em interneurónios identificados. Como exemplo, vamos nos concentrar em um tipo principal de interneuron, um subconjunto das chamadas "células cesta" (BC), que inerva o Soma e proximal dendritos de suas metas pós-sinápticos e é caracterizada por um "spiking rápido" (FS) descarregar padrão, um axónio densamente cobrindo a camada de corpo celular e a expressão da proteína de ligação a parvalbumina de cálcio (PV) 10,11. Esses interneurônios exibir grandes correntes inibitórios pós-sinápticos, bem como pré destaquemodulação sináptica da sua saída sináptica, em resposta ao GABA B R activação 12. A combinação das técnicas aqui descritas podem ser aplicadas igualmente bem para investigar mecanismos intrínsecos ou sinápticas em uma variedade de outros tipos de neurónios identificados.

Protocol

Declaração de Ética: Todos os procedimentos e manutenção de animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais, a lei alemã Bem-Estar Animal, o Conselho Europeu a Directiva 86/609 / CEE do Conselho relativa à protecção dos animais, e as orientações das autoridades locais (Berlim, T-0215/11 ) 1 Preparação de fatias Agudo-hipocampo Tome um rato transgênico (17 a 24 dias de idade), expressando a proteína fluorescente Venus / YFP sob o promotor vGAT, qu…

Representative Results

Desde que a qualidade é apreciável fatia boa, registrando tanto PCs CA1 e FS-ins podem ser alcançados com um mínimo de dificuldade. A linhagem de ratos transgênicos expressando Venus / YFP sob o promotor vGAT 13 não inequivocamente identificar FS-ins, ou de fato BCs. No entanto gravações de INs e em torno de str. piramidal, em que a densidade de FS-ins é tipicamente uma alta, resulta em um maior probabilidade de seleccionar FS-Ins (Figura 2B). FS-ins podem ser dis…

Discussion

Nós descrevemos um método que combina técnicas eletrofisiológicas e neuroanatômicas para caracterizar funcionalmente neurônios morphologically- e identificados neuroquimicamente in vitro; em especial, os diversos tipos de Ins inibitórios corticais. Os principais aspectos do processo são: (1) pré-seleção de potenciais INs; (2) gravação intracelular e visualização neurônio; e, finalmente, (3) análise morfológica e imunocitoquímica de Ins gravados. Embora este estudo dirigiu-ins PV, em particular, o prot…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Ina Wolter pelo seu excelente assistência técnica. Ratos transgênicos VGAT-Vênus foram gerados pelos drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi e Y. Kawaguchi no Instituto Nacional de Ciências Fisiológicas, Okazaki, Japão, usando pCS2-Venus fornecido pelo Dr. A. Miyawaki.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transgenic vGAT-venus rats see Uematsu et al., 2008
Venus (515 nm) goggles BLS Ltd., Hungary
Dissection tools i.e. FST For brain removal
Vibratome Leica VT1200S Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope Olympus, Japan BX50WI With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera Till Photonics VX55
505 nm LED system Cairn Research OptiLED system Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. 
Multiclamp 700B  Axon Instruments Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers 
WinWCP acquisition software John Dempster, Strathclyde University Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. 
Electrode Puller Sutter P-97 Used with box-filament
Borosilicate pipette glass Hilgenberg, Germany 1405020 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump Gilson Minipuls Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer Custom made
Digital Manometer Supertech, Hungary
Isolated constant voltage stimulator Digitimer, Cambridge DS-2A
Biocytin Invitrogen B1592 Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine 
DL-AP5(V) disodium salt Abcam Biochemicals ab120271
DNQX disodium salt Abcam Biochemicals ab120169 Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531) Abcam Biochemicals ab120042 Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen Abcam Biochemicals ab120325
CGP-55,845 hydrochloride Tocris 1248
Streptavidin 647 Invitrogen S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody Swant, Switzerland 235 Working concentration 1:5000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody  Invitrogen A11030 If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum Vector Labs S-1000
Microscopy slides Any high quality brand 
Glass coverslips Usually 22 x 22 mm
Agar spacers Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope Olympus, Japan Fluoview FV1000 Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ) http://fiji.sc/Fiji See Schindelin et al., 2012

Referências

  1. Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
  2. Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
  3. Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
  4. Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
  5. Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
  6. Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neurociência. 79 (3), 629-648 (1997).
  7. Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
  8. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
  9. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  10. Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
  11. Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
  12. Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
  13. Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
  14. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
  15. Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
  16. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  18. Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
  19. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  20. Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
  21. Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
  22. Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
check_url/pt/51706?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J. Vis. Exp. (91), e51706, doi:10.3791/51706 (2014).

View Video