चूहे में electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए डिजाइन और Ultralight वजन का निर्माण, समायोज्य बहु इलेक्ट्रोड जांच
Summary
Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.
Abstract
माउस, मुसलमानों मस्कुलस में शारीरिक जांच की संख्या, Microcircuit विच्छेदन और रोग मॉडलिंग के लिए लक्षित कर आनुवंशिक के तरीकों में विकास paralleling, एक हाल ही में वृद्धि का अनुभव किया है. optogenetics का परिचय, उदाहरण के लिए, एक अभूतपूर्व अस्थायी समाधान पर, आनुवंशिक रूप से पहचान न्यूरॉन्स की द्विदिश हेरफेर के लिए अनुमति दी गई है. इन उपकरणों को भुनाने और मस्तिष्क microcircuits के बीच गतिशील बातचीत में जानकारी हासिल करने के लिए, यह एक दोनों सिर से तय की और स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर रही तैयारियों में गहरी इस छोटे कृंतक के मस्तिष्क के भीतर न्यूरॉन्स की टुकड़ियों से रिकॉर्ड करने की क्षमता है कि आवश्यक है. गहरी संरचनाओं और अलग सेल परतों से रिकॉर्ड करने के लिए वांछित मस्तिष्क क्षेत्रों की ओर इलेक्ट्रोड की सटीक उन्नति की अनुमति देता है कि एक तैयारी की आवश्यकता है. तंत्रिका ensembles रिकॉर्ड करने के लिए, यह प्रत्येक इलेक्ट्रोड neighb जाते वक्त व्यक्ति की कोशिकाओं को हल करने के लिए प्रयोगकर्ता की अनुमति, स्वतंत्र रूप से चल होना आवश्यक है किoring इलेक्ट्रोड undisturbed. एक स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर माउस में दोनों ऐसा करने के लिए, हल्के लचीला, और विशिष्ट मस्तिष्क संरचना लक्षित करने के लिए उच्च अनुकूलन है कि एक इलेक्ट्रोड ड्राइव की आवश्यकता है.
व्यक्तिगत रूप से अनुकूलन और आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों से इकट्ठा कर रहे हैं कि microdrive इलेक्ट्रोड सरणियों डिजाइन और लघु, ultralight वजन, fabricating के लिए एक तकनीक प्रस्तुत किया है. इन उपकरणों को आसानी से स्केलेबल हैं और संरचना निशाना बनाया जा रहा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है; यह प्राकृतिक व्यवहार के दौरान एक स्वतंत्र रूप से बर्ताव जानवर में thalamic और cortical क्षेत्रों से रिकॉर्ड करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है.
Introduction
मुसलमानों मस्कुलस जल्दी आनुवंशिक रूप से पहचान न्यूरॉन्स की Microcircuit स्तर के विच्छेदन में और मानव रोग के माउस मॉडल की जांच में रुचि physiologists के लिए पसंद के पशु मॉडल बन गया है, इसकी वजह से आनुवंशिक Tractability के लिए है. उदाहरण के लिए, ऐसे optogenetic और रासायनिक आनुवंशिक actuators के रूप में कारण आनुवंशिक उपकरण, की हाल ही में शुरू experimentalists व्यवहार 1-4 में पहचान तंत्रिका सर्किट की आवश्यकता है और प्रचुरता का परीक्षण करने के लिए अनुमति दी गई है. पुनः संयोजक ट्रांसजेनिक माउस ड्राइवर लाइनों (CRE लाइनों), की व्यापक उपलब्धता इन प्रयोगों 5 के लिए माउस के मूल्य को जोड़ने, न्यूरॉन उपप्रकार लक्षित कर रहे हैं जिसके द्वारा प्रयोगात्मक आसानी परिलक्षित किया है.
इसी तरह, आनुवंशिक स्क्रीन और सामान्य तंत्रिका विज्ञान और मानसिक विकारों के जीनोम चौड़ा संघों मस्तिष्क बीमारी 6,7 के लिए आनुवंशिक जोखिम कारकों की पहचान की है. बढ़ते के साथ संयुक्त इन अग्रिमों,आनुवंशिक हेरफेर और चूहों में जीनोम इंजीनियरिंग के लिए उपकरण बॉक्स, यह मानव रोग मॉडलिंग के लिए विकल्प के जीव बना दिया है. रोग मॉडल और कारण आनुवंशिक उपकरणों के संयोजन मस्तिष्क बीमारी को समझने और हस्तक्षेपों के लिए सर्किट स्तर के लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक अभूतपूर्व अवसर प्रदान करता है.
पूरी तरह से इन आणविक उपकरणों को भुनाने और स्वास्थ्य और रोग में Microcircuit समारोह में जानकारी हासिल करने के लिए, यह मस्तिष्क की गतिविधियों के शारीरिक readouts साथ जोड़ी उन्हें आवश्यक है. आदर्श रूप में, प्रयोगकर्ता एकल कक्ष संकल्प को बनाए रखते हुए न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या की निगरानी करने में सक्षम होगा. स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर पशुओं में कोशिकी, बहु इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग इस तरह के अवसर प्रदान करते हैं; हालांकि, माउस में इस तकनीक का उपयोग सीमित कर दिया गया है. छोटे लक्ष्यों (जैसे, हिप्पोकैम्पस में सीए 1 परत) से रिकॉर्ड करने के लिए, समायोज्य इलेक्ट्रोड का उपयोग Surgic निम्नलिखित रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में छोटे आंदोलनों के रूप में आवश्यक हैअल आरोपण यह असंभव रिकॉर्डिंग स्थिरता 8,9 बनाए रखने के लिए करते हैं. परंपरागत रूप से, माउस में प्रयोग किया जाता है जब मस्तिष्क के भीतर इलेक्ट्रोड वजन सीमाएं लागू करने के लिए कदम नियोजित किया गया है कि तरीकों, इस जीव में व्यवहार के साथ न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या के युगल रिकॉर्डिंग करने के लिए यह चुनौतीपूर्ण बना रही है.
इधर, तरीकों को व्यक्तिगत optogenetics संगत, निशाना बनाया जा रहा मस्तिष्क क्षेत्र को विकसित कर रहे हैं कि लघु, अल्ट्रा हल्के, microelectrode सरणियों fabricating के लिए पेश कर रहे हैं, और आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों से इकट्ठे हुए. बहु इलेक्ट्रोड "Hyperdrive" के भीतर प्रत्येक "microdrive" भाड़ से टोक़ प्रतिक्रिया Hyperdrive शरीर में निर्मित इलेक्ट्रोड और एक प्लास्टिक रेल अग्रिम करने के लिए एक वसंत और स्क्रू तंत्र,, इस्तेमाल करता. पहला, 3 डी मुद्रण के लिए एक सीएडी कार्यक्रम में Hyperdrive निकायों और microdrives तैयार करने की प्रक्रिया में वर्णित है. अनुकूलित कर रहे हैं कि Hyperdrive निकायों द्वारा डिजाइनविशिष्ट संरचनाओं के लिए, यह लक्ष्यीकरण की शुद्धता को बढ़ाने के लिए और आगे की तैयारी की उपज बढ़ाने के लिए संभव है. दूसरा, निर्माण की प्रक्रिया बहु इलेक्ट्रोड सरणी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं कि भागों से हाथ से इकट्ठा किया है जिसमें विस्तार में वर्णित है. इस तकनीक प्राकृतिक foraging और स्फूर्त कार्य के दौरान स्वतंत्र रूप से बर्ताव जानवर में हिप्पोकैम्पस, चेतक और प्रांतस्था में न्यूरॉन्स की टुकड़ियों से रिकॉर्ड करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल माउस में एक या एक से अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए एक अल्ट्रा हल्के microdrive सरणी के निर्माण की प्रक्रिया की रूपरेखा. निर्माण के अंतिम चरण के बाद, Hyperdrive मानक शल्य आरोपण तकनीक का उपयोग कर प्रत्यारोपित और दंत सीमेंट के साथ माउस की खोपड़ी से चिपका होने के लिए तैयार है. माउस को हाथ से रोका जाता है, जबकि पोस्ट आरोपण, इलेक्ट्रोड प्रत्येक स्वतंत्र रूप से एक छोटे से शराबी का उपयोग उन्नत किया जा सकता है. प्रत्येक इलेक्ट्रोड अग्रिमों पेंच की पिच से निर्धारित होता है कि बारी प्रति दूरी. आधा और चौथाई बदल जाता है अधिक से अधिक संकल्प के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि यहां संदर्भित शिकंजा का उपयोग करना, प्रत्येक इलेक्ट्रोड बारी के अनुसार लगभग 150 मिमी अग्रिम.
चित्रा 1 बी में स्केच के आयामों प्रत्यारोपण के कुल आकार का निर्धारण, इसलिए, bidirectionally प्रत्यारोपण पैमाने पर करने के लिए एक स्पष्ट तरीका है कि महत्वपूर्ण स्केच पर आयाम बदल रहा है. साथ ही, वेंशिकंजा की ई लंबाई गहरी मस्तिष्क संरचना को लक्षित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. उन प्रकाश और स्टील से भी कम भंगुर हैं के रूप में हम कस्टम, टाइटेनियम शिकंजा बनाया सलाह देते हैं. Antitorque रेल पेंच लंबाई के साथ रैखिक पैमाने पर करने की जरूरत है, और इस बिंदु पर हम इन संरचनाओं मुद्रित किया जा सकता है, जिस पर अधिकतम लम्बाई निर्धारित नहीं किया है कि ध्यान दें. कई मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए, नीचे टुकड़ा के आकार संशोधित किया जा सकता है. जाना जाता आकार वाशर (मोटाई 200 माइक्रोन), के अलावा (उदाहरण, हिप्पोकैम्पस और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स के लिए) अलग मस्तिष्क संरचना को लक्षित Polyimides के बीच की जरूरत spacers प्रदान कर सके. ये नीचे टुकड़ा विधानसभा चरणों में शामिल है, और epoxy मज़बूत बनाता है के बाद बाद में काट किया जा सकता है.
इस डिजाइन की एक बड़ी सीमा मालिकाना सॉफ्टवेयर (इस मामले में Solidworks) पर अपनी निर्भरता है. न्यूनतम इंजीनियरिंग backg के साथ इस तरह के उपकरणों को डिजाइन करने के लिए अनुकूल उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस प्रदान कि खुला स्रोत कार्यक्रमों के भविष्य के विकासदौर तंत्रिका विज्ञान समुदाय को जबरदस्त लाभ होगा.
इस विधि से मौजूदा तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, डिजाइन, बहुत कुछ नमूने (चित्रा 1) पर निर्भर सरल है. दूसरा, यह अपने विधानसभा में जाने के लिए कोई चिकित्सकीय सीमेंट या भारी सामग्री की आवश्यकता अल्ट्रा प्रकाश है. इसी तरह की कार्यक्षमता के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रत्यारोपण के वजन का लगभग एक तिहाई – कुल मिलाकर, यह लगभग 1.7 ग्राम वजन का होता है. ; प्रत्यारोपण शरीर कई स्रोतों से मुद्रित 3D जा सकता है (उदाहरण के approto.com के लिए, लेकिन कई दूसरों रहे हैं) – तीसरा, यह सुनिश्चित करने के लिए कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है शिकंजा कस्टम (उदाहरण antrinonline.com के लिए) बनाया जा सकता है; स्प्रिंग्स (उदाहरण leesprings.com के लिए) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं; और एक परिणाम के रूप में पूरे विधानसभा की प्रक्रिया एक दिन में हो सकता है. अंत में, इन प्रत्यारोपण प्राकृतिक foraging के दौरान कई मस्तिष्क क्षेत्रों से रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, संरचित व्यवहार कार्यों और नींद (चित्रा5).
इस पद्धति का भविष्य अनुप्रयोगों अपनी scalability को लागू करने में शामिल हैं. यह प्रत्यारोपण bidirectionally) 1 बदलकर बस चित्रा 1 बी में स्केच और नमूनों microdrive पात्र (चित्रा -1) का, 2) संख्या का आकार बढ़ाया जा सकता है कि संभावना है. उदाहरण के लिए, यह प्रारंभिक विकास में स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर रही चूहों से रिकॉर्ड करने के लिए नीचे की ओर बढ़ाया, और चूहे, खरगोश, ferrets और शायद nonhuman primates से रिकॉर्ड करने के लिए ऊपर की तरफ बढ़ाया जा सकता है.
एक अंतिम शब्द उल्लिखित विधि के सफल क्रियान्वयन के लिए महत्वपूर्ण है कि वे संलग्न डिजाइन फ़ाइलों .stl को लागू करने में कोई भी संशोधन प्रोटोटाइप है कि पाठक को याद दिलाने के लिए है. पाठक संलग्न डिजाइन एक "आंकड़ा 8" antitorque रेल होता है कि, उदाहरण के लिए, सूचना देगा. यह बात अक्सर हम इन छेद ड्रिल आवश्यक है कि के रूप में, 3 डी प्रिंटिंग की सीमा दी सर्वश्रेष्ठ डिजाइन संभव था. यह एक चक्र के बाद, कंप्यूटर अनुप्रयोग होगाromise स्थिरता, लेकिन यह एक वर्ग हो रहा है या एक angled आकार ड्रिलिंग द्वारा 3 डी प्रिंटिंग खामियों को ठीक करने की क्षमता की सीमा होती.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the Wilson lab for their helpful advice on the fabrication method.
This work was supported by the Simons Foundation, a NIH pathway to independence career award from the NINDS and a NARSAD Young Investigator Award (to M.M.H.) as well as grants from the NIH (to M.A.W.).
Materials
| Part Name | Manufacturer | Catalogue # (if applicable) | Part Description |
| Microdrive screws | Antrin | Half Circle .6UNM Titanium Screws. 8mm thread. 9mm length from under head. | |
| Tap-ease | AGS CO. | #TA2 | Tapping Grease |
| Microdrives | See .STL file | ||
| Drive Body | See .STL file | ||
| Outer Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113300022-012 | Length:12’’, |
| ID:.0071’’, | |||
| OD:.0116’’, | |||
| WALL:.00225’’ | |||
| Inner Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113900001-012 | Length: 12’’, |
| ID:.0035’’, | |||
| OD:.0055’’, | |||
| WALL:.001’’ | |||
| Grounding Wire | A-M Systems, Inc. | Catalog # 791900 | .008'' Bare, .011'' Coated |
| Tri-Flow | Teflon based lubricant – Aerosol | ||
| Microdrive Springs | Lee Spring | Part # CB0050B 07 E | Outside Diameter: 1.016 mm |
| Hole Diameter: 1.193 mm | |||
| Wire Diameter: 0.127 mm | |||
| Free Length 10.160 mm | |||
| Solid Length 3.581 mm | |||
| Z-poxy 5 Minute | Pacer Technology (Zap) | PT37 | |
| Silver Paint | GC Electronics | Part #: 22-023 | Silver Print II |
| Tri-Flow | 20009 | ||
| 26 Gauge Hypodermic Tube – Stainless Steel | Small Parts | HTXX-26T-12-10 | Length: 12’’ |
| ID: .012’’ | |||
| OD: .018’’ | |||
| EIB screws | Component Supply Co. | MX-0090-03SP | #00-90 x 3/16’’ |
| Fine Scissors – Toughcut | Fine Science Tools | 14058-09 | 22mm |
| Transparency Paper | 3M | PP2500 | |
| Aluminum Foil | Reynold's Wrap Heavy Duty | Extra Thick |
Referências
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- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Halassa, M. M., et al. Selective optical drive of thalamic reticular nucleus generates thalamic bursts and cortical spindles. Nat Neurosci. 14, 1118-1120 (2011).
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