Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.
El número de investigaciones fisiológicas en el musculus ratón, mus, ha experimentado un reciente aumento, en paralelo con el crecimiento en los métodos de genética dirigidos por disección microcircuito y el modelado de la enfermedad. La introducción de la optogenética, por ejemplo, ha permitido para la manipulación bidireccional de las neuronas identificadas genéticamente-, a una resolución temporal sin precedentes. Para sacar provecho de estas herramientas y obtener una perspectiva de las interacciones dinámicas entre los microcircuitos cerebrales, es esencial que se tiene la capacidad de grabar de conjuntos de neuronas profundamente dentro del cerebro de este pequeño roedor, tanto en los preparativos de la cabeza-fijo y comportarse libremente. Para grabar desde estructuras profundas y capas de células diferenciadas requiere una preparación que permite el avance preciso de electrodos hacia regiones cerebrales deseadas. Para grabar conjuntos neurales, es necesario que cada electrodo sea movible independientemente, permitiendo que el experimentador para resolver las células individuales, dejando Barrioelectrodos ORING inalteradas. Para hacer las dos cosas en un ratón libremente comportarse requiere una unidad de electrodo que es ligero, resistente y altamente personalizable para orientar las estructuras específicas del cerebro.
Se presenta una técnica para el diseño y fabricación en miniatura, peso ultraligero, guías de electrodos Microdrive que son individualmente personalizable y fácil montaje de las piezas disponibles en el mercado. Estos dispositivos son fácilmente escalables y pueden adaptarse a la estructura en la mira; se ha utilizado con éxito para grabar desde regiones talámicas y corticales en un animal de comportarse libremente durante el comportamiento natural.
Mus musculus tiene, debido a su maleabilidad genética, se convierten rápidamente en el modelo animal de elección para los fisiólogos interesados en la disección de nivel de microcircuito de neuronas genéticamente determinadas, y en la investigación de los modelos de ratón de la enfermedad humana. Por ejemplo, la reciente introducción de herramientas genéticas causales, tales como actuadores optogenética genéticos y químicos ha permitido experimentadores para probar la necesidad y la suficiencia de los circuitos neuronales identificados en el comportamiento de 1-4. La amplia disponibilidad de transgénicos conductor líneas de ratón recombinante (Cre-líneas), ha ampliado la facilidad experimental por el cual subtipos neuronales están dirigidos, añadiendo al valor del ratón para estos experimentos 5.
Del mismo modo, las pantallas de genética y amplias asociaciones del genoma de los trastornos neurológicos y psiquiátricos comunes han facilitado la identificación de factores de riesgo genético para la enfermedad cerebral 6,7. Estos avances, combinados con el crecimientocaja de herramientas para la manipulación genética y la ingeniería del genoma en ratones, han hecho que el organismo de elección para modelar enfermedades humanas. La combinación de modelos de enfermedad y herramientas genéticas causales ofrece una oportunidad sin precedentes para la comprensión de las enfermedades del cerebro y la identificación de objetivos a nivel de circuito para las intervenciones.
Para aprovechar plenamente estas herramientas moleculares y obtener una perspectiva de la función microcircuito en la salud y la enfermedad, que es esencial para acoplarlos con lecturas fisiológicas de la actividad cerebral. Idealmente, el experimentador sería capaz de supervisar un gran número de neuronas mientras se mantiene la resolución de una sola célula. Extracelulares, grabaciones multi-electrodos en animales comportarse libremente ofrecen tales oportunidades; sin embargo, el uso de esta tecnología en el ratón ha sido limitada. Para grabar de blancos pequeños (por ejemplo, la capa CA1 en el hipocampo), es necesario ya que los pequeños movimientos en electrodos de registro siguientes Surgic el uso de electrodos ajustablesal implante que sea imposible mantener la estabilidad de grabación 8,9. Tradicionalmente, los métodos que se han empleado para mover los electrodos dentro del cerebro imponen limitaciones de peso cuando se usa en el ratón, por lo que es difícil de grabación de par de un gran número de neuronas con el comportamiento en este organismo.
Aquí, se introducen métodos para fabricar,, microelectrodos ultra-ligeros en miniatura que son individualmente personalizable para la región del cerebro está dirigida, la optogenética-compatible y fácilmente ensamblados de partes disponibles en el mercado. Cada "Microdrive" dentro de la multi-electrodo "hyperdrive" utiliza un mecanismo de resorte y el tornillo para hacer avanzar el electrodo y un riel de plástico, construido en el cuerpo hyperdrive, para contrarrestar el par del tornillo. En primer lugar, se describe el proceso de diseño de los órganos de hipervelocidad y microdrives en un programa de CAD para la impresión 3D. Mediante el diseño de cuerpos de hipervelocidad que se personalizanpara estructuras específicas, es posible aumentar la precisión de la focalización y para aumentar aún más el rendimiento de la preparación. En segundo lugar, el proceso de fabricación se describe en detalle, en el que la matriz multi-electrodo está montado a mano a partir de piezas que están disponibles comercialmente. Esta técnica se ha utilizado, con éxito, para grabar desde conjuntos de neuronas en el hipocampo, el tálamo y la corteza en el animal libremente comportarse durante forrajeo natural y operante tareas.
Este protocolo describe el proceso de construcción de una matriz Microdrive ultra-ligero para dirigir una o varias regiones del cerebro en el ratón. Después de las etapas finales de la construcción, la hipervelocidad está listo para ser implantado utilizando técnicas de implantación quirúrgica estándar y se fija al cráneo del ratón con cemento dental. Mensaje de la implantación, los electrodos puede ser avanzado de forma independiente cada uno con un destornillador pequeño, mientras que el ratón está inmovilizado con las manos. La distancia que cada uno por turno avances de electrodos se determina por el paso del tornillo. Utilizando los tornillos que se hace referencia aquí avanza cada electrodo aproximadamente 150 mm por vuelta, aunque medio y cuartos de vueltas se pueden usar para una mayor resolución.
Las dimensiones del trazo de la figura 1B determinan el tamaño global del implante, por lo tanto, una manera obvia a escala implantes bidireccionalmente es cambiar las dimensiones en que bosquejo crítico. Además, THe longitud de los tornillos puede ser extendida para apuntar estructuras cerebrales más profundos. Recomendamos ENCARGO tornillos de titanio, como los que son luz y menos frágil que el acero. Tenga en cuenta que los rieles antipar necesitan para escalar linealmente con la longitud del tornillo, y en este punto no han determinado la duración máxima a que estas estructuras se pueden imprimir. Para dirigirse a múltiples regiones del cerebro, la forma de la pieza de fondo puede ser modificado. La adición de arandelas conocidos de tamaño (espesor de 200 micras), podría proporcionar espaciadores necesarios entre poliimidas dirigidas a estructuras cerebrales separadas (por ejemplo, el hipocampo y la corteza prefrontal). Estos podrían ser incluidos en los pasos de montaje pieza inferior, y más tarde cortados después se endurece la resina epoxi.
Una gran limitación de este diseño es su dependencia del software propietario (Solidworks en este caso). El desarrollo futuro de los programas de código abierto que proporcionan interfaces de usuario amigable propicio para el diseño de estos equipos con un mínimo backg ingenieríaronda sería de enorme beneficio para la comunidad de las neurociencias.
Este método ofrece varias ventajas sobre los métodos existentes. En primer lugar, el diseño es simple, depende de muy pocos bocetos (Figura 1). En segundo lugar, es ultra-ligero, que no requiere cemento dental o un material grueso para entrar en su asamblea. En general, pesa alrededor de 1,7 g – casi un tercio del peso de los implantes disponibles comercialmente de una funcionalidad similar. En tercer lugar, no requiere equipo especializado para hacer – el cuerpo del implante puede ser impreso en 3D a partir de múltiples fuentes (por ejemplo approto.com, pero hay varios otros); los tornillos pueden ser personalizados (por ejemplo antrinonline.com); los resortes están disponibles comercialmente (por ejemplo leesprings.com); y como resultado todo el proceso de montaje puede suceder en un día. Finalmente, estos implantes se han utilizado para grabar desde múltiples regiones del cerebro durante la búsqueda de alimento natural, las tareas de comportamiento estructurados y del sueño (Figura5).
Las futuras aplicaciones de este método incluyen la implementación de su escalabilidad. Es probable que el implante puede ser bidireccional escala simplemente cambiando 1) el tamaño del trazo de la figura 1B y, 2) el número de receptáculos Microdrive (Figura 1D) estampadas. Por ejemplo, se puede escalar hacia abajo para registro de ratones comportarse libremente en el desarrollo temprano, y se escala hacia arriba para grabar a partir de ratas, conejos, hurones y primates no humanos tal vez.
Una última palabra es para recordar al lector que fundamental para la implementación exitosa del método descrito es para crear prototipos que implementan las modificaciones a .stl archivos de diseño unidos. El lector se dará cuenta, por ejemplo, que el diseño adjunto figura la "figura 8" carril antipar. Este fue el mejor diseño posible dada la limitación de la impresión en 3D, ya que a menudo se requiere que perforamos estos agujeros. Tener que ser un círculo, lo compestabilidad romise, pero tener que ser un cuadrado o una forma en ángulo limitaría la capacidad de fijar las imperfecciones de impresión en 3D mediante perforación.
The authors have nothing to disclose.
We thank members of the Wilson lab for their helpful advice on the fabrication method.
This work was supported by the Simons Foundation, a NIH pathway to independence career award from the NINDS and a NARSAD Young Investigator Award (to M.M.H.) as well as grants from the NIH (to M.A.W.).
Part Name | Manufacturer | Catalogue # (if applicable) | Part Description |
Microdrive screws | Antrin | Half Circle .6UNM Titanium Screws. 8mm thread. 9mm length from under head. | |
Tap-ease | AGS CO. | #TA2 | Tapping Grease |
Microdrives | See .STL file | ||
Drive Body | See .STL file | ||
Outer Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113300022-012 | Length:12’’, |
ID:.0071’’, | |||
OD:.0116’’, | |||
WALL:.00225’’ | |||
Inner Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113900001-012 | Length: 12’’, |
ID:.0035’’, | |||
OD:.0055’’, | |||
WALL:.001’’ | |||
Grounding Wire | A-M Systems, Inc. | Catalog # 791900 | .008'' Bare, .011'' Coated |
Tri-Flow | Teflon based lubricant – Aerosol | ||
Microdrive Springs | Lee Spring | Part # CB0050B 07 E | Outside Diameter: 1.016 mm |
Hole Diameter: 1.193 mm | |||
Wire Diameter: 0.127 mm | |||
Free Length 10.160 mm | |||
Solid Length 3.581 mm | |||
Z-poxy 5 Minute | Pacer Technology (Zap) | PT37 | |
Silver Paint | GC Electronics | Part #: 22-023 | Silver Print II |
Tri-Flow | 20009 | ||
26 Gauge Hypodermic Tube – Stainless Steel | Small Parts | HTXX-26T-12-10 | Length: 12’’ |
ID: .012’’ | |||
OD: .018’’ | |||
EIB screws | Component Supply Co. | MX-0090-03SP | #00-90 x 3/16’’ |
Fine Scissors – Toughcut | Fine Science Tools | 14058-09 | 22mm |
Transparency Paper | 3M | PP2500 | |
Aluminum Foil | Reynold's Wrap Heavy Duty | Extra Thick |