עיצוב וייצור של Ultralight משקל, בדיקות Multi-אלקטרודה מתכוונן לקלטות אלקטרו בעכברים
Summary
Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.
Abstract
מספר החקירות הפיזיולוגיות בmusculus העכבר, mus, חווה עליות אחרונות, במקביל לגידול בשיטות של גנטי מיקוד לנתיחה Microcircuit ודוגמנות מחלה. כניסתה של optogenetics, למשל, אפשרה למניפולציה דו כיוונית של נוירונים גנטיים מזוהים, ברזולוציה של זמן חסר תקדים. כדי לנצל את הכלים הללו ולקבל תובנות לגבי אינטראקציות דינמיות בין שבבי מוח, זה חיוני כי יש אחד את היכולת להקליט מהרכבים של נוירונים בעומק המוח של מכרסם קטן זה, בשתי הכנות-קבוע בראש ומתנהג באופן חופשי. כדי להקליט ממבנים עמוקים ושכבות תאים שונות דורש הכנה המאפשרת קידום מדויק של אלקטרודות לאזורים במוח רצויים. כדי להקליט הרכבים עצביים, יש צורך כי כל אלקטרודה להיות עצמאי מטלטלין, המאפשר הנסיין כדי לפתור תאים בודדים תוך השארת neighbאלקטרודות oring ללא הפרעה. לעשות את שניהם בעכבר מתנהג בחופשיות דורש כונן אלקטרודה שהוא קל משקל, עמיד, והתאמה אישית למיקוד מבנים ספציפיים במוח.
טכניקה לעיצוב ובודה זעירה, במשקל האולטרה, מערכי אלקטרודה דיסק קשיחים זעירים, כי הם באופן אישי להתאמה אישית ובקלות הורכבה מחלקים זמינים מסחרי מוצגת. מכשירים אלו הם להרחבה בקלות ויכולים להיות מותאמים אישית כדי להיות ממוקד במבנה; זה כבר נעשה שימוש בהצלחה כדי להקליט מאזורי התלמוס וקליפת מוח בבעלי חיים מתנהגים באופן חופשי במהלך התנהגות טבעית.
Introduction
יש musculus Mus, בשל tractability הגנטי שלו, הפך למודל של בעלי החיים שבה נקטה פיזיולוגים המעוניינים בנתיחה ברמת Microcircuit של נוירונים גנטיים מזוהים ובחקירת מודלים של עכברים של מחלה אנושית במהירות. לדוגמא, המבוא האחרון של כלים גנטיים סיבתי, כגון מפעילים גנטיים optogenetic והכימיים אפשר experimentalists כדי לבדוק את הנחיצות והסתפקות של מעגלים עצביים שזוהו בהתנהגות 1-4. הזמינות רחבה של קווי רקומביננטי מהונדסים מנהל התקן של עכבר (Cre-קווים), הגבירה את הקלות הניסיונית שבו תת נוירון ממוקדים, והוסיף לערכו של העכבר לניסויים אלה 5.
כמו כן, מסכי גנטיים ועמותות רחבות הגנום של הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות נפוצות הקלו על זיהוי גורמי סיכון גנטיים למחלה במוח 6,7. התפתחויות אלה, בשילוב עם הגידולארגז כלים למניפולציה גנטית והנדסת הגנום בעכברים, הפכו אותו לאורגניזם מועדף על דוגמנות מחלה אנושית. השילוב של מודלים של מחלות וכלים גנטיים סיבתי מספק הזדמנות חסרת תקדים להבנת מחלה במוח וזיהוי מטרות ברמת מעגל להתערבויות.
כדי לנצל באופן מלא על כלים המולקולריים אלה ולקבל תובנות לגבי תפקוד Microcircuit בבריאות ובחוליים, זה חיוני לבני זוגם מוצא במידע פיסיולוגי של פעילות המוח. באופן אידיאלי, הניסוי יהיה מסוגל לעקוב אחר מספר רב של תאי עצב, תוך שמירה על הרזולוציה התא בודדת. תאי, הקלטות רבות אלקטרודה בבעלי חיים מתנהגים באופן חופשי מספקות הזדמנות כזו; עם זאת, השימוש בטכנולוגיה זו בעכבר היה מוגבל. כדי להקליט ממטרות קטנות (לדוגמא, שכבת CA1 בהיפוקמפוס), השימוש באלקטרודות להתאמה הוא הכרחית כתנועות קטנות באלקטרודות הקלטה הבאות surgicהשתלת אל תעשה את זה בלתי אפשרי לשמור על יציבות הקלטת 8,9. באופן מסורתי, השיטות שכבר מועסקות לעבור אלקטרודות בתוך המוח להטיל מגבלות משקל בעת שימוש בעכבר, מה שהופך את אתגר להקלטה כמה מספר גדול של נוירונים עם התנהגות באורגניזם זה.
כאן, שיטות הם הציגו לבודת מערכים זעירים, קלים במיוחד, microelectrode כי הם בנפרד להתאמה אישית לאזור במוח להיות ממוקד, optogenetics תואם, בקלות ובהורכבו מחלקים זמינים מסחרי. כל "דיסק קשיח זעיר" בתוך "ההינע" רבת אלקטרודה מנצל מנגנון קפיץ ובורג לקדם את האלקטרודה ורכבת פלסטיק, שנבנה אל תוך גוף ההינע, כדי לנטרל מומנט מהבורג. ראשית, התהליך של עיצוב הגוף וmicrodrives הינע בתכנית CAD להדפסת 3D מתואר. על ידי עיצוב גופי הינע המותאמיםלמבנים ספציפיים, אפשר להגדיל את הדיוק של מיקוד ולהגדיל את התשואה של ההכנה נוספת. שנית, תהליך הייצור מתואר בפירוט, שבו המערך רב האלקטרודה והורכב ביד מחלקים שהם זמינים באופן מסחרי. נעשתה שימוש בטכניקה זו, בהצלחה, כדי להקליט מהרכבים של תאי עצב בהיפוקמפוס, תלמוס וקליפת המוח בבעלי החיים מתנהגים באופן חופשי במהלך ליקוט טבעי ומשימות אופרנטית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את תהליך בניית מערך דיסק קשיח זעיר קל במיוחד למיקוד אזורים במוח בודד או מרובים בעכבר. לאחר השלבים הסופיים של הבנייה, ההינע מוכן להיות מושתל תוך שימוש בטכניקות השתלה כירורגית סטנדרטית ומודבק לגולגולת של העכבר עם מלט שיניים. השתלת הודעה, יכולה כל אחד להיות מתקדמת אלקטרודות באופן עצמאי באמצעות מברג קטן, בזמן שהעכבר מרוסן על ידי יד. המרחק לפי תור שכל התקדמות אלקטרודה נקבעה על ידי גובה הצליל של הבורג. שימוש בברגים בהפניה כאן מקדם כל אלקטרודה כ 150 מ"מ בכל תור, אם כי מחצית והרבע סיבובים עשויות לשמש לרזולוציה גבוהה יותר.
הממדים של הסקיצה באיור 1 לקבוע את הגודל הכולל של השתל, ולכן, דרך ברורה לגודל שתלי bidirectionally היא לשנות את הממדים שבסקיצה קריטית. בנוסף, האורך דואר של הברגים ניתן להאריך למקד מבנים מוחיים עמוקים יותר. אנו ממליצים בהתאמה אישית ברגי טיטניום, כמו אלה הם קלים ופחות שבירים יותר מפלדה. שים לב שמסילות antitorque צריכים לשנות את קנה מידה באופן ליניארי עם אורך הבורג, ובשלב זה אנחנו לא קבענו את האורך המקסימאלי שבו ניתן להדפיס את המבנים האלה. כדי למקד את האזורים במוח מרובים, את הצורה של החתיכה התחתונה יכולה להיות שונה. התוספת של המנקים ידועים בגודל (עובי 200 מיקרומטר), יכולה לספק מפרידי דרושים בין polyimides מיקוד מבנים מוחיים נפרדים (לדוגמא, היפוקמפוס וקליפת מוח הקדם חזיתית). אלה יכולים להיות כלולים בצעדי ההרכבה חתיכה התחתון, ולאחר מכן נותקו לאחר אפוקסי מתקשה.
מגבלה גדולה של העיצוב הזה היא התלות שלה בתוכנת קניינית (Solidworks במקרה זה). פיתוח עתידי של תוכנות קוד פתוחות המספקות ממשקי משתמש ידידותיים תורם לעיצוב ציוד כזה עם backg הנדסה המינימליתעגול יהיה יתרון עצום לקהילת מדעי המוח.
שיטה זו מספקת מספר יתרונות על פני שיטות קיימות. ראשית, העיצוב הוא פשוט, תלוי במעט מאוד סקיצות (איור 1). שנית, זה קל במיוחד, אין צורך בדבק דנטלי או חומר כבד להיכנס להרכבה שלה. בסך הכל, הוא שוקל סביב 1.7 g – כמעט שליש מהמשקל של שתלים זמינים המסחרית של פונקציונליות דומה. שלישית, זה לא דורש ציוד מיוחד כדי להפוך את – גוף השתל ניתן 3D מודפס ממקורות מרובים (לדוגמא approto.com, אבל יש כמה אחרים); הברגים יכולים להיות מותאם אישית עשו (לדוגמא antrinonline.com); המעיינות זמינות מסחרי (לדוגמא leesprings.com); וכתוצאה מכך תהליך ההרכבה כולה יכול לקרות ביום. לבסוף, שתלים אלה היו בשימוש כדי להקליט מאזורים במוח מרובים במהלך ליקוט טבעי, משימות התנהגותיות מובנים ושינה (איור5).
יישומים עתידיים של שיטה זו כוללים יישום יכולת ההרחבה שלה. סביר להניח כי השתל וניתן לשנות bidirectionally פשוט על ידי שינוי 1) בגודל של הסקיצה באיור 1 ו, 2) מספר קיבול דיסק הקשיח הזעיר (1D איור) בדוגמת. לדוגמא, ניתן לשנות אותו כלפי מטה לשיא מעכברים מתנהגים בחופשיות בשלב מוקדם בהתפתחות, וטפס כלפי מעלה כדי להקליט מחולדות, ארנבות, חמוסים ופרימטים אולי לא אנושיים.
מילה אחרונה היא להזכיר לקורא שקריטי ליישום מוצלח של השיטה שתוארה הוא אב טיפוס לכל שינויים שהם ליישם ל.stl עיצוב קבצים המצורפים. הקורא יבחין, למשל, שהעיצוב המצורף מכיל רכבת "דמות 8" antitorque. זה היה העיצוב הטוב ביותר אפשרי בהתחשב במגבלה של הדפסת 3D, כפי שהוא נדרש לעתים קרובות שאנחנו לקדוח חורים אלה. לאחר אותו להיות מעגל, היה compיציבות romise, אבל יש לזה להיות מרובע או צורת זווית תגביל את היכולת לתקן את פגמי הדפסת 3D על ידי קידוח.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the Wilson lab for their helpful advice on the fabrication method.
This work was supported by the Simons Foundation, a NIH pathway to independence career award from the NINDS and a NARSAD Young Investigator Award (to M.M.H.) as well as grants from the NIH (to M.A.W.).
Materials
| Part Name | Manufacturer | Catalogue # (if applicable) | Part Description |
| Microdrive screws | Antrin | Half Circle .6UNM Titanium Screws. 8mm thread. 9mm length from under head. | |
| Tap-ease | AGS CO. | #TA2 | Tapping Grease |
| Microdrives | See .STL file | ||
| Drive Body | See .STL file | ||
| Outer Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113300022-012 | Length:12’’, |
| ID:.0071’’, | |||
| OD:.0116’’, | |||
| WALL:.00225’’ | |||
| Inner Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113900001-012 | Length: 12’’, |
| ID:.0035’’, | |||
| OD:.0055’’, | |||
| WALL:.001’’ | |||
| Grounding Wire | A-M Systems, Inc. | Catalog # 791900 | .008'' Bare, .011'' Coated |
| Tri-Flow | Teflon based lubricant – Aerosol | ||
| Microdrive Springs | Lee Spring | Part # CB0050B 07 E | Outside Diameter: 1.016 mm |
| Hole Diameter: 1.193 mm | |||
| Wire Diameter: 0.127 mm | |||
| Free Length 10.160 mm | |||
| Solid Length 3.581 mm | |||
| Z-poxy 5 Minute | Pacer Technology (Zap) | PT37 | |
| Silver Paint | GC Electronics | Part #: 22-023 | Silver Print II |
| Tri-Flow | 20009 | ||
| 26 Gauge Hypodermic Tube – Stainless Steel | Small Parts | HTXX-26T-12-10 | Length: 12’’ |
| ID: .012’’ | |||
| OD: .018’’ | |||
| EIB screws | Component Supply Co. | MX-0090-03SP | #00-90 x 3/16’’ |
| Fine Scissors – Toughcut | Fine Science Tools | 14058-09 | 22mm |
| Transparency Paper | 3M | PP2500 | |
| Aluminum Foil | Reynold's Wrap Heavy Duty | Extra Thick |
Referências
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Halassa, M. M., et al. Selective optical drive of thalamic reticular nucleus generates thalamic bursts and cortical spindles. Nat Neurosci. 14, 1118-1120 (2011).
- Tsien, J. Z., et al. Subregion- and cell type-restricted gene knockout in mouse brain. Cell. 87, 1317-1326 (1996).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E. Animal models of neuropsychiatric disorders. Nat Neurosci. 13, 1161-1169 (2010).
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261, 1055-1058 (1993).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Reactivation of hippocampal ensemble memories during sleep. Science. 265, 676-679 (1994).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), (2009).
