Design und Fertigung von Ultraleichtgewicht, verstellbare Multi-Elektroden-Sonden für elektrophysiologischen Ableitungen in Mäuse
Summary
Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.
Abstract
Die Zahl der physiologische Untersuchungen in der Maus, Mus musculus, hat eine jüngste Anstieg erlebt, parallel zum Wachstum der Methoden der genetischen Targeting für Mikroschaltung Dissektion und Krankheit Modellierung. Die Einführung der Optogenetik, hat beispielsweise zur bidirektionalen Manipulation genetisch identifiziert Neuronen erlaubt, mit einer beispiellosen zeitlichen Auflösung. Um diese Tools zu nutzen und einen Einblick in dynamischen Wechselwirkungen zwischen Gehirnmikroschaltungen, ist es wichtig, dass man die Fähigkeit hat, aus Ensembles von Nervenzellen tief im Gehirn des kleinen Nager aufnehmen, in beiden Kopf-festen und frei verhalten Zubereitungen. Um von Tiefenstrukturen und unterschiedliche Zellschichten aufnehmen erfordert eine präzise Vorbereitung, die Weiterentwicklung von Elektroden auf Wunsch Hirnregionen ermöglicht. Neuronale Ensembles aufzuzeichnen, ist es erforderlich, dass jede Elektrode unabhängig voneinander beweglich sein, so dass der Experimentator, einzelne Zellen zu lösen, während NEIGHBoring Elektroden ungestört. Sowohl in einer frei verhalten Maus tun erfordert eine Elektrodenplatte, die leicht, robust und sehr individuell für bestimmte Zielhirnstrukturen ist.
Eine Technik, die für die Gestaltung und Herstellung von Miniatur-, Ultraleicht-Gewicht, Microdrive Elektrodenarrays, die individuell anpassbar und leicht aus handelsüblichen Teilen zusammengesetzt sind vorgestellt. Diese Geräte sind leicht skalierbar und kann auf die Struktur, die gezielt angepasst werden; es wurde erfolgreich verwendet, um von Thalamus und kortikale Regionen in einem frei verhalten Tier während natürliche Verhalten aufzuzeichnen.
Introduction
Mus musculus hat, aufgrund seiner genetischen Lenkbarkeit, schnell das Tiermodell der Wahl für Physiologen interessiert Mikroschaltung-Level-Dissektion der genetisch identifiziert Neuronen und bei der Untersuchung von Mausmodellen menschlicher Erkrankungen zu werden. Zum Beispiel hat die kürzliche Einführung der kausalen genetischen Werkzeugen, wie optogenetische und chemische genetische Aktoren erlaubt Experimentatoren, die Notwendigkeit und Angemessenheit der festgestellten neuronalen Schaltkreise im Verhalten 1-4 zu testen. Die breite Verfügbarkeit von rekombinanten transgenen Maustreiber Leitungen (Cre-Linien), hat die experimentelle Leichtigkeit, mit der Neuron-Subtypen gezielt verstärkt werden, indem auf den Wert der Maus für diese Experimente 5.
Ebenso haben genetische Screens und genomweiten Verbände der häufigsten neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen die Identifizierung genetischer Risikofaktoren für die Erkrankung des Gehirns 6,7 erleichtert. Diese Fortschritte, verbunden mit der wachsendenWerkzeugkasten für die genetische Manipulation und Genomtechnik bei Mäusen, haben es der Organismus der Wahl für die Modellierung menschlichen Krankheit gemacht. Die Kombination von Krankheitsmodellen und kausalen genetischen Werkzeuge bietet eine beispiellose Gelegenheit für das Verständnis des Gehirns Krankheit und Identifizierungsschaltung-Level-Ziele für Interventionen.
Um vollständig zu kapitalisieren dieser molekularen Werkzeuge und einen Einblick in Mikroschaltfunktion in Gesundheit und Krankheit, ist es wichtig zu koppeln sie mit physiologischen Anzeigen der Hirnaktivität. Idealerweise ist der Experimentator in der Lage wäre, eine große Anzahl von Neuronen zu überwachen, während die Einzelzellauflösung. Extrazellulären, Multi-Elektroden-Aufnahmen in frei lebenden Tier bieten solche Gelegenheit; Die Verwendung dieser Technologie in der Maus war begrenzt. Von kleinen Zielen (zB CA1-Schicht im Hippocampus) aufzuzeichnen, notwendig, kleine Bewegungen in der Aufzeichnungselektroden folgenden Surgic ist die Verwendung von einstellbaren Elektrodenal Implantation unmöglich machen Aufnahmestabilität 8,9 zu halten. Traditionell sind die Methoden, die verwendet wurden, um zu bewegen Elektroden im Gehirn auferlegen Gewichtsbeschränkungen, wenn in der Maus verwendet wird, was es schwierig macht zu koppeln Aufnahme einer großen Zahl von Neuronen mit dem Verhalten in diesem Organismus.
Hier werden Verfahren zur Herstellung von Miniatur-, ultraleichten, Mikroarrays, die individuell anpassbar an die Hirnregion, die gezielt Optogenetik-kompatibel sind, eingeführt und leicht aus handelsüblichen Teilen zusammengesetzt. Jeder "Microdrive" im Multi-Elektroden-"Hyperdrive" verwendet eine Feder-Schraubenmechanismus, um die Elektrode und eine Kunststoffschiene voran, in den Hyperantrieb Körper gebaut, um das Drehmoment von der Schraube entgegenwirken. Erstens, der Prozess der Gestaltung der Hyperantrieb Körper und Microdrives in einem CAD-Programm für den 3D-Druck beschrieben. Durch die Gestaltung Hyperantrieb Körper, die angepasst werdenfür bestimmte Strukturen ist es möglich, die Genauigkeit der Ausrichtung zu erhöhen und die Ausbeute der Herstellung zu erhöhen. Zweitens wird das Herstellungsverfahren im Detail, wobei das Mehrelektrodenanordnung wird von Hand aus Teilen, die im Handel erhältlich sind gebaut beschrieben. Diese Technik wurde verwendet, erfolgreich, um von Ensembles von Neuronen im Hippocampus, Thalamus und Cortex im frei verhalten Tier während natürliche Nahrungssuche und oper Aufgaben aufnehmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Konstruktion eines ultraleichten Microdrive-Array für Ausrichtung auf einen einzigen oder mehrere Hirnregionen in der Maus. Nach dem Abschluss der Konstruktion ist der Hyperantrieb bereit, mit Standard-Operationstechniken implantiert und mit der Maus die Schädel mit Zahnzement befestigt werden. Nach der Implantation können die Elektroden jeweils voran unabhängig mit einem kleinen Schraubendreher werden, während die Maus mit der Hand zurückgehalten. Der Abstand pro Runde, dass jede Elektrode Fortschritte wird durch die Steigung der Schraube bestimmt. Mit den Schrauben hier verwiesen rückt jede Elektrode ca. 150 mm pro Umdrehung, wenn auch halbe und viertel-Windungen für höhere Auflösung verwendet werden.
Die Dimensionen der Skizze in Figur 1B zu bestimmen, die Gesamtgröße des Implantats ist daher offensichtlich, dass die Möglichkeit, Implantate bidirektional zu skalieren, um die Maße zu diesem kritischen Skizze ändern. Zusätzlich the Länge der Schrauben kann erweitert werden, um tiefer Gehirnstrukturen zielen. Wir empfehlen maßgeschneiderte Titanschrauben, wie Licht und weniger spröde als Stahl sind. Beachten Sie, dass die Gegendrehschienen müssen linear mit der Schneckenlänge zu skalieren, und an diesem Punkt haben wir nicht bestimmt die maximale Länge, bei denen diese Strukturen können gedruckt werden. Mehrere Gehirnregionen Target, kann die Form des unteren Teils verändert werden. Die Zugabe bekannter großen Scheiben (Dicke 200 um), kann Abstandshalter zwischen Polyimide Targeting getrennten Strukturen des Gehirns (zB Hippocampus und präfrontalen Kortex) benötigt wird. Diese könnten in den Unterteil Montageschritte aufgenommen werden und später abgeschnitten, nachdem das Epoxidharz aushärtet.
Ein großer Nachteil dieser Konstruktion ist ihre Abhängigkeit von proprietärer Software (Solid in diesem Fall). Zukünftige Entwicklung der Open-Source-Programme, die benutzerfreundliche Gestaltung von Schnittstellen zu solchen Geräten mit minimalem Engineering backg bieten förderlichRunde wäre von enormer Vorteil für den Neurowissenschaften Gemeinschaft zu sein.
Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Verfahren. Erstens ist das Design einfach, abhängig von sehr wenigen Skizzen (Abbildung 1). Zweitens ist es extrem leicht, erfordern keine Zahnzement oder schweres Material in seine Montage zu gehen. Insgesamt wiegt es rund 1,7 g – fast ein Drittel des Gewichts von kommerziell verfügbaren Implantate ähnliche Funktionalität. Drittens, es erfordert keine spezielle Ausrüstung zu machen – der Implantatkörper können aus mehreren Quellen 3D gedruckt werden (zum Beispiel approto.com, aber es gibt einige andere); Die Schrauben können nach Maß sein (zum Beispiel antrinonline.com); Die Federn sind im Handel erhältlich (zum Beispiel leesprings.com); und als Ergebnis die gesamte Montagevorgang an einem Tag geschehen. Schließlich sind diese Implantate verwendet wurden, um aus mehreren Hirnregionen während der natürlichen Nahrungssuche erfassen, strukturierte Verhaltens Aufgaben und Schlaf (Abbildung5).
Zukünftige Anwendungen dieser Methode sind der Umsetzung ihrer Skalierbarkeit. Es ist wahrscheinlich, dass das Implantat bidirektional einfach durch Veränderung 1 skaliert) die Größe der Skizze in Abbildung 1B und 2) die Anzahl der Microdrive Aufnahmen (1D) strukturiert. Beispielsweise kann es nach unten zum Datensatz aus frei verhalten Mäuse früh in der Entwicklung skaliert werden und skaliert oben aus Ratten, Kaninchen, Frettchen und möglicherweise nicht-menschlichen Primaten zu erfassen.
Ein letztes Wort ist es, die Leser, die entscheidend für eine erfolgreiche Umsetzung der skizzierten Methode ist, um alle Änderungen zu implementieren, um sie Design-Dateien beigefügt .stl Prototypen erinnern. Der Leser wird bemerken, zum Beispiel, dass die angehängte Entwurf enthält eine "Figur 8" Gegendreh Schiene. Dies war die beste Ausführung möglich angesichts der Beschränkung des 3D-Drucks, da ist es oft erforderlich, dass wir diese Löcher zu bohren. Nachdem es ein Kreis sein, comp würderomise Stabilität, aber es mit ein Quadrat oder eine abgewinkelte Form würde die Fähigkeit, 3D-Druck Unvollkommenheiten durch Bohren fixieren zu begrenzen.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the Wilson lab for their helpful advice on the fabrication method.
This work was supported by the Simons Foundation, a NIH pathway to independence career award from the NINDS and a NARSAD Young Investigator Award (to M.M.H.) as well as grants from the NIH (to M.A.W.).
Materials
| Part Name | Manufacturer | Catalogue # (if applicable) | Part Description |
| Microdrive screws | Antrin | Half Circle .6UNM Titanium Screws. 8mm thread. 9mm length from under head. | |
| Tap-ease | AGS CO. | #TA2 | Tapping Grease |
| Microdrives | See .STL file | ||
| Drive Body | See .STL file | ||
| Outer Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113300022-012 | Length:12’’, |
| ID:.0071’’, | |||
| OD:.0116’’, | |||
| WALL:.00225’’ | |||
| Inner Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113900001-012 | Length: 12’’, |
| ID:.0035’’, | |||
| OD:.0055’’, | |||
| WALL:.001’’ | |||
| Grounding Wire | A-M Systems, Inc. | Catalog # 791900 | .008'' Bare, .011'' Coated |
| Tri-Flow | Teflon based lubricant – Aerosol | ||
| Microdrive Springs | Lee Spring | Part # CB0050B 07 E | Outside Diameter: 1.016 mm |
| Hole Diameter: 1.193 mm | |||
| Wire Diameter: 0.127 mm | |||
| Free Length 10.160 mm | |||
| Solid Length 3.581 mm | |||
| Z-poxy 5 Minute | Pacer Technology (Zap) | PT37 | |
| Silver Paint | GC Electronics | Part #: 22-023 | Silver Print II |
| Tri-Flow | 20009 | ||
| 26 Gauge Hypodermic Tube – Stainless Steel | Small Parts | HTXX-26T-12-10 | Length: 12’’ |
| ID: .012’’ | |||
| OD: .018’’ | |||
| EIB screws | Component Supply Co. | MX-0090-03SP | #00-90 x 3/16’’ |
| Fine Scissors – Toughcut | Fine Science Tools | 14058-09 | 22mm |
| Transparency Paper | 3M | PP2500 | |
| Aluminum Foil | Reynold's Wrap Heavy Duty | Extra Thick |
Referências
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