Design og fabrikation af Ultralight Vægt, Justerbare multi-elektrode Sonder til elektrofysiologiske målinger i mus
Summary
Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.
Abstract
Antallet af fysiologiske undersøgelser i mus, Mus musculus, har oplevet en nylig bølge, parallelt med væksten i metoder til genetisk målretning til mikrokredsløb dissektion og sygdom modellering. Indførelsen af optogenetics, for eksempel, er tilladt for tovejs manipulation af genetisk identificerede neuroner på en hidtil uset tidsopløsning. At udnytte disse værktøjer og få indsigt i dynamiske samspil mellem hjernens mikrokredsløb, er det vigtigt, at man har evnen til at optage fra ensembler af neuroner dybt inde i hjernen på denne lille gnaver, både hoved-fast og frit opfører præparater. Hvis du vil optage fra dybe strukturer og distinkte cellelag kræver et præparat, der giver præcis fremføring af elektroder i retning af de ønskede områder af hjernen. Hvis du vil optage neurale ensembler, er det nødvendigt, at hver elektrode være uafhængigt bevægelig, så forsøgslederen til at løse individuelle celler mens kvartORING elektroder uforstyrret. At gøre begge dele på en frit opfører mus kræver en elektrode drev, der er let, robust og yderst tilpasselig til at målrette specifikke hjernens strukturer.
En teknik til at designe og fabrikere miniature, ultralet vægt, Microdrive elektrodeopstillinger, der er individuelt tilpasses og samles let fra kommercielt tilgængelige dele præsenteres. Disse enheder er let skalerbar og kan tilpasses til den struktur, bliver målrettet; det har været brugt med held at optage fra thalamiske og kortikale regioner i et frit opfører dyr under naturlige adfærd.
Introduction
Mus musculus har, på grund af sin genetiske medgørlighed, hurtigt blive dyremodel valg for fysiologerne interesseret i mikrokredsløb niveau dissektion af genetisk identificerede neuroner og undersøge musemodeller for human sygdom. For eksempel har den nylige indførelse af kausale genetiske værktøjer, såsom optogenetic og kemiske genetiske aktuatorer tilladt eksperimentalister at teste nødvendigheden og tilstrækkeligheden af identificerede neurale kredsløb i opførsel 1-4. Den store tilgængelighed af rekombinante transgene mus driver linjer (CRE-poster), har forstærket den eksperimentelle lethed, hvormed neuron undertyper er målrettet, tilføjer til værdien af musen til disse eksperimenter 5.
Ligeledes har genetiske skærme og genom sammenslutninger af almindelige neurologiske og psykiatriske lidelser lettet identifikation af genetiske risikofaktorer for hjerne sygdom 6,7. Disse fremskridt, kombineret med den stigendeværktøjskasse til genetisk manipulation og genom teknik i mus, har gjort det organismen valg for modellering sygdom hos mennesker. Kombinationen af sygdomsmodeller og kausale genetiske værktøjer giver en enestående mulighed for at forstå hjernen sygdom og identificere kredsløb niveau mål for interventioner.
For fuldt ud at udnytte disse molekylære værktøjer og få indsigt i mikrokredsløb funktion i sundhed og sygdom, er det vigtigt at koble dem med fysiologiske udlæsninger af hjernens aktivitet. Ideelt set ville forsøgslederen være i stand til at overvåge et stort antal neuroner, samtidig med at den enkelt celle opløsning. Ekstracellulære, multi-elektrode optagelser i frit opfører dyr give en sådan mulighed; Imidlertid har anvendelsen af denne teknologi i musen været begrænset. Hvis du vil optage fra små mål (f.eks CA1 lag i hippocampus), er nødvendig, da små bevægelser i registreringselektroder efter Surgic udnyttelse af justerbare elektroderal implantation gør det umuligt at opretholde optagelsen stabilitet 8,9. Traditionelt, de metoder, der er blevet anvendt til at flytte elektroder i hjernen indføre vægtbegrænsninger når de anvendes i mus, hvilket gør det svært at koble optagelse af et stort antal neuroner med adfærd i denne organisme.
Her introduceres metoder til fremstilling af miniature, ultra-lette, mikroelektrode arrays, der er individuelt tilpassede til hjernen regionen bliver målrettet, optogenetics-kompatible, og samles let fra kommercielt tilgængelige dele. Hver "mikrodrev" i multi-elektrode "hyperdrive" udnytter en fjeder-og skrue mekanisme til at fremme elektrode og en plast jernbane, bygget ind i hyperdrive kroppen, for at modvirke moment fra skruen. For det første er processen med at designe hyperdrive organer og microdrives i et CAD-program til 3D-print beskrevet. Ved at designe hyperdrive organer, der er tilpassettil specifikke strukturer, er det muligt at øge præcisionen af målretning og for yderligere at øge udbyttet af præparatet. For det andet er fremstillingsprocessen beskrevet i detaljer, hvor multi-elektrode array samlet manuelt fra dele, der er kommercielt tilgængelige. Denne teknik er blevet anvendt med held, til at optage fra ensembler af neuroner i hippocampus, thalamus og cortex i frit opfører dyr i naturlig fouragering og operant opgaver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver processen med at opbygge en ultra-letvægts microdrive array til at målrette en enkelt eller flere områder af hjernen i mus. Efter de sidste trin for byggeri, hyperdrive er klar til at blive implanteret under anvendelse af standard kirurgisk implantation teknikker og fastgjort til musens kranium med dental cement. Indlæg implantation, kan elektroderne hver fremføres uafhængigt ved hjælp af en lille skruetrækker, mens musen er fastholdt i hånden. Afstanden per tur, som hver elektrode fremskridt bestemmes af banen af skruen. Brug de skruer, der refereres her fremfører hver elektrode ca. 150 mm per runde, selvom halve og kvarte-vendinger kan bruges til større opløsning.
Dimensionerne af skitsen i figur 1B bestemme den samlede størrelse af implantatet derfor en indlysende måde at skalere implantater tovejs er at ændre dimensionerne på det kritiske skitse. Derudover the længden af skruerne kan udvides til at målrette dybere hjernens strukturer. Vi anbefaler specialfremstillede titanium skruer, da de er lette og mindre skørt end stål. Bemærk at antitorque skinner nødt til at skalere lineært med skruen længde, og på dette punkt har vi ikke bestemt den maksimale længde, som disse strukturer kan udskrives. For at målrette flere områder af hjernen, kan formen af bundstykket ændres. Tilsætning af kendte mellemstore skiver (tykkelse 200 um), kunne give afstandsstykker er nødvendige mellem polyimider rettet separate hjernens strukturer (f.eks hippocampus og præfrontale cortex). Disse kan indgå i det nederste stykke samling trin, og senere afbrød efter epoxyen hærder.
En stor begrænsning ved dette design er dens afhængighed af leverandørejet software (SolidWorks i dette tilfælde). Fremtidig udvikling af open source-programmer, der giver brugervenlige grænseflader befordrende for at designe sådant udstyr med minimal teknik backgrunde vil være af enorm fordel for neurovidenskab samfund.
Denne metode giver adskillige fordele i forhold til eksisterende metoder. For det første design er enkel, afhængig af meget få skitser (figur 1). For det andet er ultralet, som ikke kræver dentalcement eller tungt materiale til at gå ind i sin samling. Samlet set den vejer omkring 1,7 g – næsten en tredjedel af vægten af kommercielt tilgængelige implantater af tilsvarende funktionalitet. For det tredje kræver nogen specialiseret udstyr til at gøre – implantatlegemet kan 3D udskrives fra flere kilder (f.eks approto.com, men der er flere andre); skruerne kan skræddersyet (f.eks antrinonline.com); fjedrene er kommercielt tilgængelige (for eksempel leesprings.com); og som et resultat hele samleprocessen kan ske på en dag. Endelig har disse implantater er blevet brugt til at optage fra flere forskellige områder af hjernen under naturlig fouragering, strukturerede adfærdsmæssige opgaver og søvn (figur5).
Fremtidige anvendelser af denne metode er eksempelvis at gennemføre sin skalerbarhed. Det er sandsynligt, at implantatet kan bidirektionelt skaleres blot ved at ændre 1) størrelsen af skitsen i figur 1B og 2) antallet af Microdrive- beholdere (figur 1D) mønstrede. For eksempel kan det skaleres ned til rekord i frit opfører mus tidligt i udvikling, og skaleres op til at optage fra rotter, kaniner, fritter og måske ikke-menneskelige primater.
En sidste bemærkning er at minde læseren om, at afgørende for en vellykket gennemførelse af den skitserede metode er at prototype eventuelle ændringer, de gennemfører for at STL design vedhæftede filer. Læseren vil bemærke, for eksempel, at den vedhæftede design indeholder en "figur 8" antitorque jernbane. Dette var det bedste design muligt i betragtning begrænsning af 3D-print, da det ofte er nødvendigt at vi bore disse huller. Under det være en cirkel, ville compromise stabilitet, men at have det være et kvadrat eller en vinklet form vil begrænse muligheden for at fastsætte 3D-print ufuldkommenheder ved boring.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the Wilson lab for their helpful advice on the fabrication method.
This work was supported by the Simons Foundation, a NIH pathway to independence career award from the NINDS and a NARSAD Young Investigator Award (to M.M.H.) as well as grants from the NIH (to M.A.W.).
Materials
| Part Name | Manufacturer | Catalogue # (if applicable) | Part Description |
| Microdrive screws | Antrin | Half Circle .6UNM Titanium Screws. 8mm thread. 9mm length from under head. | |
| Tap-ease | AGS CO. | #TA2 | Tapping Grease |
| Microdrives | See .STL file | ||
| Drive Body | See .STL file | ||
| Outer Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113300022-012 | Length:12’’, |
| ID:.0071’’, | |||
| OD:.0116’’, | |||
| WALL:.00225’’ | |||
| Inner Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113900001-012 | Length: 12’’, |
| ID:.0035’’, | |||
| OD:.0055’’, | |||
| WALL:.001’’ | |||
| Grounding Wire | A-M Systems, Inc. | Catalog # 791900 | .008'' Bare, .011'' Coated |
| Tri-Flow | Teflon based lubricant – Aerosol | ||
| Microdrive Springs | Lee Spring | Part # CB0050B 07 E | Outside Diameter: 1.016 mm |
| Hole Diameter: 1.193 mm | |||
| Wire Diameter: 0.127 mm | |||
| Free Length 10.160 mm | |||
| Solid Length 3.581 mm | |||
| Z-poxy 5 Minute | Pacer Technology (Zap) | PT37 | |
| Silver Paint | GC Electronics | Part #: 22-023 | Silver Print II |
| Tri-Flow | 20009 | ||
| 26 Gauge Hypodermic Tube – Stainless Steel | Small Parts | HTXX-26T-12-10 | Length: 12’’ |
| ID: .012’’ | |||
| OD: .018’’ | |||
| EIB screws | Component Supply Co. | MX-0090-03SP | #00-90 x 3/16’’ |
| Fine Scissors – Toughcut | Fine Science Tools | 14058-09 | 22mm |
| Transparency Paper | 3M | PP2500 | |
| Aluminum Foil | Reynold's Wrap Heavy Duty | Extra Thick |
Referências
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Halassa, M. M., et al. Selective optical drive of thalamic reticular nucleus generates thalamic bursts and cortical spindles. Nat Neurosci. 14, 1118-1120 (2011).
- Tsien, J. Z., et al. Subregion- and cell type-restricted gene knockout in mouse brain. Cell. 87, 1317-1326 (1996).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E. Animal models of neuropsychiatric disorders. Nat Neurosci. 13, 1161-1169 (2010).
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261, 1055-1058 (1993).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Reactivation of hippocampal ensemble memories during sleep. Science. 265, 676-679 (1994).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), (2009).
