تصميم وتصنيع وخفيفة الوزن، قابل للتعديل تحقيقات متعددة القطب للتسجيلات الكهربية في الفئران
Summary
Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.
Abstract
عدد التحقيقات الفسيولوجية في العضلة الماوس، المصحف، شهدت طفرة الأخيرة، في موازاة نمو في أساليب الوراثية استهداف للتشريح المتناهية الصغر والنمذجة المرض. إدخال optogenetics، على سبيل المثال، وقد سمح للتلاعب ثنائي الاتجاه من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وراثيا، في قرار غير مسبوق الزمني. للاستفادة من هذه الأدوات واكتساب نظرة ثاقبة التفاعلات الدينامية بين رقائق الدماغ، فمن الضروري أن أحد لديه القدرة على تسجيل من مجموعات من الخلايا العصبية في عمق الدماغ من هذه القوارض الصغيرة، في كل من الاستعدادات الثابتة الرأس ويتصرف بحرية. لتسجيل من البنى العميقة وطبقات خلية متميزة يتطلب إعداد يسمح التقدم الدقيق من الأقطاب الكهربائية نحو مناطق الدماغ المطلوبة. لتسجيل الفرق العصبية، فمن الضروري أن يكون كل قطب كهربائي متحرك بشكل مستقل، والسماح للالمجرب لحل الخلايا الفردية بينما تترك neighbدون عائق أقطاب oring. للقيام على حد سواء في الماوس يتصرف بحرية يتطلب محرك الكهربائي التي هي خفيفة الوزن ومرنة، وقابلة للتخصيص للغاية لاستهداف هياكل محددة في الدماغ.
ويرد تقنية لتصميم وتصنيع مصغرة، الوزن الخفيفة جدا، صفائف مايكرو محرك الكهربائي التي هي قابلة للتخصيص بشكل فردي وتجميعها بسهولة من أجزاء المتاحة تجاريا. هذه الأجهزة هي قابلة للتطوير بسهولة ويمكن تخصيصها لبنية استهدافهم. وقد استخدم بنجاح لتسجيل من المناطق القشرية والمهادية في حيوان يتصرف بحرية خلال السلوك الطبيعي.
Introduction
المصحف العضلة لها، نظرا لقابلية الإستطراق الجيني، سرعان ما تصبح نموذج حيواني المفضل للفسيولوجي المهتمين في تشريح على مستوى المتناهية الصغر من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وراثيا والتحقيق في نماذج الماوس من الأمراض التي تصيب البشر. على سبيل المثال، الأخذ في الآونة الأخيرة من الأدوات الوراثية السببية، مثل المحركات optogenetic الوراثية والكيميائية سمح التجريبيون لاختبار الضرورة والاكتفاء الدوائر العصبية التي تم تحديدها في سلوك 1-4. توافر واسعة من خطوط المعدلة وراثيا تشغيل الماوس المؤتلف (لجنة المساواة العرقية خطوط)، وتضخيم سهولة التجريبية التي تستهدف فرعية الخلايا العصبية، إضافة إلى قيمة الفأرة لهذه التجارب 5.
وبالمثل، شاشات الوراثية والجينوم الجمعيات واسعة من الاضطرابات العصبية والنفسية المشتركة وتسهيل تحديد عوامل الخطر الجينية للمرض الدماغ 6،7. هذه التطورات، جنبا إلى جنب مع النموجعلت الأدوات للتلاعب الجيني والهندسة الجينية في الفئران، والكائن في الاختيار لنمذجة الأمراض التي تصيب البشر. مزيج من نماذج المرض والأدوات الوراثية المسببة يوفر فرصة غير مسبوقة لفهم مرض الدماغ وتحديد الأهداف على مستوى الدائرة للتدخلات.
للاستفادة الكاملة من هذه الأدوات الجزيئية واكتساب نظرة ثاقبة وظيفة المتناهية الصغر في الصحة والمرض، فمن الضروري لزوجين لهم قراءات الفسيولوجية للنشاط الدماغ. من الناحية المثالية، فإن المجرب يكون قادرا على مراقبة عدد كبير من الخلايا العصبية مع الحفاظ على قرار خلية واحدة. خارج الخلية، تسجيلات متعددة الكترودات في الحيوانات تتصرف بحرية توفر مثل هذه الفرص؛ ومع ذلك، فقد تم استخدام هذه التكنولوجيا في الماوس محدود. لتسجيل من الأهداف الصغيرة (على سبيل المثال، طبقة CA1 في قرن آمون)، واستخدام أقطاب كهربائية قابلة للتعديل ضروري والحركات الصغيرة في أقطاب تسجيل التالية surgicآل زرع تجعل من المستحيل للحفاظ على الاستقرار تسجيل 8،9. تقليديا، والأساليب التي استخدمت لنقل الأقطاب داخل الدماغ تفرض قيود الوزن عند استخدامها في الماوس، مما يجعل صعوبة في تسجيل اثنين من عدد كبير من الخلايا العصبية مع السلوك في هذا الحي.
هنا، يتم إدخال أساليب لافتعال مصغرة، فائقة خفيفة الوزن، صفائف مسرى مكروي التي هي قابلة للتخصيص بشكل فردي إلى منطقة الدماغ استهدافهم، optogenetics متوافقة، وتجميعها بسهولة من أجزاء المتاحة تجاريا. كل "مايكرو محرك" في إطار متعدد القطب "hyperdrive" يستخدم آلية الربيع والمسمار لدفع كهربائي والسكك الحديدية من البلاستيك، والتي بنيت في الجسم hyperdrive، لمواجهة عزم الدوران من المسمار. أولا، يتم وصف عملية تصميم الهيئات hyperdrive وميكرودريفيس في برنامج CAD للطباعة 3D. من خلال تصميم الأجهزة hyperdrive التي يتم تخصيصهالهياكل محددة، فمن الممكن لزيادة دقة الاستهداف وزيادة العائد من التحضير. ثانيا، يتم وصف عملية تصنيع بالتفصيل، حيث يتم تجميعها في مجموعة متعددة الكترودات باليد من أجزاء المتوفرة تجاريا. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح، لتسجيل من مجموعات من الخلايا العصبية في الحصين، المهاد والقشرة في الحيوان يتصرف بحرية أثناء البحث عن الطعام الطبيعي والمهام استثابي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحدد هذا البروتوكول عملية بناء مجموعة مايكرو محرك فائقة خفيفة الوزن لاستهداف مناطق الدماغ واحدة أو متعددة في الماوس. بعد الخطوات النهائية من البناء، وhyperdrive جاهزة للزرع باستخدام تقنيات الزرع الجراحية القياسية والملصقة على الجمجمة الماوس مع الاسمنت الأسنان. زرع آخر، يمكن أن يتم تحقيق التقدم في كل الأقطاب بشكل مستقل باستخدام مفك البراغي الصغيرة، في حين يتم ضبط النفس الماوس باليد. المسافة في المقابل أن يتم تحديد كل التقدم بواسطة القطب الملعب من المسمار. باستخدام مسامير المشار إليها هنا السلف كل قطب كهربائي حوالي 150 ملم في المقابل، على الرغم من النصف والربع المنعطفات يمكن استخدامها لمزيد من القرار.
أبعاد المخطط في الشكل 1B تحدد الحجم الكلي للزرع، لذلك، وسيلة واضحة لتوسيع نطاق يزرع في الاتجاهين هي تغيير أبعاد على أن رسم حرجة. بالإضافة إلى ذلك، الويمكن تمديد طول (ه) من مسامير لاستهداف البنى الدماغية العميقة. نوصي العرف مسامير التيتانيوم، وتلك هي خفيفة وأقل هشاشة من الفولاذ. لاحظ أن القضبان antitorque حاجة لتوسيع نطاق خطيا مع طول المسمار، وعند هذه النقطة أننا لم يتحدد طول القصوى في هذه الهياكل التي يمكن طباعتها. لاستهداف مناطق الدماغ متعددة، على شكل قطعة السفلي يمكن تعديلها. إضافة غسالات الحجم المعروفة (سمك 200 ميكرون)، يمكن أن توفر الفواصل المطلوبة بين polyimides تستهدف الهياكل الدماغ منفصلة (على سبيل المثال، الحصين والقشرة قبل الجبهية). ويمكن إدراج هذه الخطوات في تجميع قطعة السفلية، وقطع في وقت لاحق من بعد يصلب الايبوكسي.
وجود قيود كبيرة من هذا التصميم هو اعتمادها على البرمجيات الاحتكارية (سوليدووركس في هذه الحالة). التنمية المستقبلية للبرامج مفتوحة المصدر التي توفر واجهات سهلة الاستخدام تساعد على تصميم هذه المعدات مع الحد الأدنى من backg الهندسةسوف الجولة تكون ذات فائدة كبيرة للمجتمع علم الأعصاب.
وهذه الطريقة توفر العديد من المزايا أكثر من الأساليب القائمة. أولا، تصميم بسيط، يعتمد على عدد قليل جدا من الرسومات (الشكل 1). الثاني، هو خفيفة للغاية، لا تتطلب الاسمنت الأسنان أو المواد الثقيلة للذهاب الى جمعيتها. عموما، ويزن حوالي 1.7 غرام – تقريبا ثلث وزن يزرع المتاحة تجاريا من وظائف مماثلة. ثالثا، أنه لا يتطلب أي معدات متخصصة لجعل – الجسم يمكن الزرع 3D المطبوعة من مصادر متعددة (على سبيل المثال approto.com، ولكن هناك العديد من الآخرين). مسامير يمكن أن يكون العرف (على سبيل المثال antrinonline.com). متوفرة تجاريا (على سبيل المثال leesprings.com) الينابيع. ونتيجة لعملية التجميع كلها يمكن أن يحدث في يوم واحد. أخيرا، وقد استخدمت هذه الغرسات لتسجيل من مناطق الدماغ متعددة أثناء البحث عن الطعام الطبيعي، والمهام السلوكية المهيكلة والنوم (الشكل5).
وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة تنفذ قابلية لها. فمن المرجح أن عملية الزرع يمكن زيادتها في الاتجاهين ببساطة عن طريق تغيير 1) حجم رسم في الشكل 1B و، 2) عدد أوعية مايكرو محرك (الشكل 1D) نمط. على سبيل المثال، يمكن زيادتها إلى أسفل إلى سجل من التصرف بحرية الفئران في وقت مبكر في عملية التنمية، وتوسيع نطاقها ليسجل صعودا من الفئران والأرانب والقوارض والرئيسيات غير البشرية ربما.
كلمة أخيرة هي لتذكير القارئ بأن حاسمة لنجاح تنفيذ الطريقة المذكورة هو النموذج الأولي أي تعديلات أنها تنفذ إلى ملفات المحكمة الخاصة بلبنان تصميم المرفقة. سوف يلاحظ القارئ، على سبيل المثال، أن تصميم المرفق يحتوي على "رقم 8" antitorque السكك الحديدية. كان هذا أفضل تصميم ممكن نظرا لمحدودية الطباعة 3D، وغالبا ما يكون مطلوبا أننا حفر هذه الثقوب. بعد أن يكون دائرة، فإن تراكبromise الاستقرار، ولكن بعد أن يكون ساحة أو أن شكل الزاوية تحد من القدرة على إصلاح عيوب الطباعة 3D بواسطة الحفر.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the Wilson lab for their helpful advice on the fabrication method.
This work was supported by the Simons Foundation, a NIH pathway to independence career award from the NINDS and a NARSAD Young Investigator Award (to M.M.H.) as well as grants from the NIH (to M.A.W.).
Materials
| Part Name | Manufacturer | Catalogue # (if applicable) | Part Description |
| Microdrive screws | Antrin | Half Circle .6UNM Titanium Screws. 8mm thread. 9mm length from under head. | |
| Tap-ease | AGS CO. | #TA2 | Tapping Grease |
| Microdrives | See .STL file | ||
| Drive Body | See .STL file | ||
| Outer Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113300022-012 | Length:12’’, |
| ID:.0071’’, | |||
| OD:.0116’’, | |||
| WALL:.00225’’ | |||
| Inner Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113900001-012 | Length: 12’’, |
| ID:.0035’’, | |||
| OD:.0055’’, | |||
| WALL:.001’’ | |||
| Grounding Wire | A-M Systems, Inc. | Catalog # 791900 | .008'' Bare, .011'' Coated |
| Tri-Flow | Teflon based lubricant – Aerosol | ||
| Microdrive Springs | Lee Spring | Part # CB0050B 07 E | Outside Diameter: 1.016 mm |
| Hole Diameter: 1.193 mm | |||
| Wire Diameter: 0.127 mm | |||
| Free Length 10.160 mm | |||
| Solid Length 3.581 mm | |||
| Z-poxy 5 Minute | Pacer Technology (Zap) | PT37 | |
| Silver Paint | GC Electronics | Part #: 22-023 | Silver Print II |
| Tri-Flow | 20009 | ||
| 26 Gauge Hypodermic Tube – Stainless Steel | Small Parts | HTXX-26T-12-10 | Length: 12’’ |
| ID: .012’’ | |||
| OD: .018’’ | |||
| EIB screws | Component Supply Co. | MX-0090-03SP | #00-90 x 3/16’’ |
| Fine Scissors – Toughcut | Fine Science Tools | 14058-09 | 22mm |
| Transparency Paper | 3M | PP2500 | |
| Aluminum Foil | Reynold's Wrap Heavy Duty | Extra Thick |
Referências
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Halassa, M. M., et al. Selective optical drive of thalamic reticular nucleus generates thalamic bursts and cortical spindles. Nat Neurosci. 14, 1118-1120 (2011).
- Tsien, J. Z., et al. Subregion- and cell type-restricted gene knockout in mouse brain. Cell. 87, 1317-1326 (1996).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E. Animal models of neuropsychiatric disorders. Nat Neurosci. 13, 1161-1169 (2010).
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261, 1055-1058 (1993).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Reactivation of hippocampal ensemble memories during sleep. Science. 265, 676-679 (1994).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), (2009).
