Analisi del danno epiteliale Prodotto da<em> Entamoeba histolytica</em> Infezione
Summary
L'infezione umana da Entamoeba histolytica porta ad amebiasi, una delle principali cause di diarrea nei paesi tropicali. L'infezione è avviata da patogeno con cellule epiteliali intestinali, provocando l'apertura dei contatti cellula-cellula e di conseguenza diarrea, a volte seguita da infezione fegato. Questo articolo fornisce un modello per valutare le interazioni primi ospite-patogeno per migliorare la nostra comprensione della patogenesi amebiasi.
Abstract
Entamoeba histolytica è l'agente eziologico di amebiasi umana, una delle principali cause di diarrea e di ascesso epatico nei paesi tropicali. L'infezione è avviata da interazione del patogeno con le cellule epiteliali intestinali. Questa interazione porta alla rottura delle strutture intercellulari come giunzioni strette (TJ). TJ assicurare la chiusura dello strato epiteliale per separare tessuto ospite dal lume intestinale. Recenti studi forniscono prove che la rottura del TJ dalla proteina EhCPADH112 parassita è un prerequisito per E. invasione histolytica che è accompagnato da disfunzione della barriera epiteliale. Pertanto, l'analisi dei meccanismi molecolari coinvolti nella TJ smontaggio durante E. histolytica invasione è di fondamentale importanza per migliorare la nostra comprensione della patogenesi amebiasi. Questo articolo presenta un modello semplice che consente la valutazione delle interazioni iniziali ospite-patogeno e il potenziale parassita invasione. I parametri da analizzare sono transepithelial resistenza elettrica, l'interazione di EhCPADH112 con i recettori di superficie epiteliali, cambiamenti di espressione e la localizzazione di marcatori giunzionale epiteliali e la localizzazione delle molecole del parassita all'interno delle cellule epiteliali.
Introduction
Entamoeba histolytica è un singolo protozoo responsabile della amebiasi umana, un'infezione intestinale delle cellule causando infiammazione e diarrea. E. histolytica infetta fino a 50 milioni di persone ogni anno, ma solo circa il 10% delle persone infette sviluppano i sintomi associati a amebiasi 1. L'infezione avviene per ingestione di alimenti contaminati o acqua contenente E. cisti histolytica. Nell'intestino, cisti producono trofozoiti vivi che aderiscono al colon mucina e proliferano 2. Trofozoiti di solito si formano le cisti che vengono escreti con feci. In altri casi e per ragioni ancora sconosciute, trofozoiti rompere lo strato epiteliale intestinale e invadono i tessuti sottostanti. Nel peggiore dei casi, entrano nel flusso sanguigno e colpiscono altri organi come il fegato 3.
Rompere la barriera epiteliale richiede interruzione di strutture transmembranal epiteliali che mantengono le cellule unite. Cellule epitelialicontatti sono formati dal complesso giunzionale apicale costituito stretto (TJ) e adherens giunzioni (AJ), e desmosomi 4. Le giunzioni più apicali sono TJ, e quindi, sono la prima barriera offeso da E. histolytica e di alcuni altri agenti patogeni durante l'invasione host. TJ sono costituiti da recettori di adesione transmembranal come claudine, occludina e molecole di adesione giunzionale (JAM), che si impegnano in interazioni eterofili omo-o con i recettori della cellula vicina. Sono intracellulare vincolati da molecole impalcatura delle occludere zonula (SO) della famiglia che collegano recettori di adesione al citoscheletro di actina per fornire ulteriore resistenza meccanica all'epitelio. TJ sono responsabili per sigillare tessuto intestinale dal lume intestinale, impedendo all'acqua eccessiva e perdita soluto. Così, dopo TJ sono interrotti dal parassita, i tessuti sono invase. E. histolytica secerne diverse molecole quali: (i) quelli coinvolti nella adesione di amebe a targcellule et 5; (Ii) fattori membrana attiva partecipano uccisione delle cellule ospiti per esocitosi, per esempio, i peptidi che formano canali ionici chiamati amoebapores 6,7; e (iii) proteinasi che degradano le proteine della matrice extracellulare e mediano tessuto disintegrazione 5,8,9.
La cisteina proteasi EhCP112 e la molecola di adesione EhADH112 che insieme formano il complesso EhCPADH112 sono due E. histolytica virulenza proteine che svolgono un ruolo importante nello smontaggio di TJ 10. Trofozoiti vivi, loro lisati totali e prodotti secreti inducono cambiamenti molecolari nel TJ complesso e funzionale disturbo della barriera epiteliale. In questo studio, è dimostrato che EhCP112 e EhADH112 interagiscono con occludina e claudin-1 proteine che portano alla internalizzazione e la degradazione delle proteine cellulari, facilitando così E. ingresso histolytica attraverso la via paracellulare.
I nostri dati e quelli of altri gruppi di 11-17 suggeriscono con forza la necessità di interazioni ospite-patogeno specifiche che consentono parassita invasione. Svelare le basi molecolari di queste interazioni è della massima importanza per una migliore comprensione della patogenesi amebiasi. Disturbo selettivo di TJ da trofozoiti, caratterizzate da un aumento della permeabilità paracellulare, può essere misurata da una diminuzione della resistenza elettrica transepiteliale (TER). Il trasferimento delle proteine parassite verso epiteli ospitanti può essere determinato da immunofluorescenza e microscopia confocale, un metodo che può anche rivelare co-localizzazione di fattori di virulenza amebe con marcatori epiteliali giunzionale indicano possibili interazioni dirette. In questo articolo, descriviamo in dettaglio come le cellule epiteliali e trofozoiti sono coltivati, raccolti e manipolati per esaminare le interazioni ospite-patogeno e le loro conseguenze.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per studiare in vitro le interazioni ospite-patogeno de corso di infezione da E. epiteliale histolytica, è fondamentale lavorare con le culture consolidate di entrambe le cellule epiteliali e trofozoiti. Ad esempio, in passato, E. culture histolytica erano stati di solito stabiliti in associazione con alcune specie di batteri o trypanosomatids 22,23. Tuttavia, co-coltivazione di E. culture histolytica è controproducente per lo studio de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).
Materials
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/mL |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ mL |
| Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6 Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/mL |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/mL |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24 well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
Referências
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
