Fastställande både värd och virus särdrag som påverkar HIV-1 patogenes och sjukdomsprogression är av största vikt för rationell vaccindesign. Det cellulära immunsvar är en viktig del av människans immunsvar mot hiv-1-infektion. Cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) är nödvändiga för den inledande kontrollen av akut viremi och låt värd att upprätta ett stabilt tillstånd (börvärde) virusmängd ^1,2. Experimentell utarmning av dessa effektorceller resulterar i förlust av viruskontroll ^3,4. Trots detta fly mutationer uppstår inom virusgenomet som gräva CTL erkännande av virusinfekterade celler ^5-9.

Vissa HLA-alleler har förknippats med lägre virusnivåer och långsammare sjukdomsprogression med B * 57, B * 27 och B * 81 ^10-15. En del av den skyddande fördelen av HLA klass I-alleler kan tillskrivas det faktum att de är inriktade funktionellt begränsade regioner av genomet, såsom Gagoch selektera för escape-mutationer som minskar förmågan hos viruset att replikera in vitro ^16-21. Även flykt från det cellulära immunsystemet är fördelaktigt för viruset i samband med väljar HLA klass I allel, kan effekten av dessa mutationer har differential konsekvenser för värden vid överföring till en HLA-inkompatibla individ ^22,23. Därför kommer förstå effekterna av överförda HLA-associerade utrymnings mutationer på virusreplikakapaciteten vara viktigt att öka våra kunskaper om tidiga HIV-1 patogenes.

Även om stora framsteg har gjorts för att identifiera och karakterisera fitness defekter enskilda flykt mutationer associerade med specifika HLA klass I alleler ^24-29, naturligt förekommande HIV-1-isolat har unika och komplexa spår av HLA-associerade polymorfism, troligen härrör från HLA medierad immun tryck av olika immunogenetiska bakgrunder ^30. I aprevious analys Goepfert et al. visade att en ansamling av HLA-associerade mutationer i de överförda Gag sekvenser härledda från 88 akut infekterade Zambians associerades med en minskning av börvärde virusmängd ^31. Detta tyder på att överföring av skadliga utrymnings mutationer, särskilt i Gag, till HLA-inkompatibla mottagare ger en klinisk nytta, och kan bero på försvagade virusreplikation. Framåt är det absolut nödvändigt att studera hur komplicerade kombinationer av Gag polymorfism inom naturligt förekommande isolat arbetar tillsammans för att definiera egenskaperna hos den överförda virus såsom replikakapacitet, och hur tidigt replikering kan i sin tur påverka HIV-1 kliniska parametrar och sent skede patogenes.

Brockman et al. Visade först en länk mellan replikeringskapacitet gag-pro sekvenser isolerade under kronisk skede infektion och virus i både subtyp C och B-infektioner32-35. Den experimentella metod som presenteras i dessa studier, även lämplig för prövningen av replikeringskapacitet sekvenser härledda från kroniskt infekterade individer in vitro, har flera tekniska förbehåll och begränsningar som gör studerar HIV-1 replikationsförmåga in subtyp C akut infekterade individer svårt. Denna metod förlitar sig på rekombination av befolkningen baserade PCR-amplifierade sekvenserna in i subtyp B NL4-3 provirus, som blev framtagen ur delar från LAV, ett laboratorium anpassat virus lager ^36. Virus generationen åstadkoms genom samtransfektion av en CEM-baserade T-cellinje ³⁷ med PCR-amplikoner och digere delta- gag-pro NL4-3 DNA. Denna metod kräver utväxt av viruset under en period av veckor till månader, potentiellt skev arten av det utvunna viruset lager i förhållande till de virala kvasispecies in vivo och därför förändra mätningen av replikeringsförmåga in vitro. Denna metod Iär mer lämpligt för att studera kroniskt infekterade individer, där den väljer effektivt för virus med högsta replikationsförmåga, och där kloning många olika virusvarianter från ett stort antal kroniskt infekterade individer är ganska arbetskrävande och därför inte genomförbart. Men inom en akut infekterad individ, finns det i allmänhet 1-2 varianter närvarande, och därmed eliminerar risken för snedställning typen av återvunna viruset lager, genom in vitro selektionstryck, möjliggör en mer exakt bedömning av in vitro-replikationsförmåga. För det andra kräver den här metoden rekombination subtyp C gag-pro-sekvenser i en subtyp B härledd ryggraden, och skulle kunna införa ryggrad inkompatibilitet fördomar i analysen. På grund av dessa begränsningar, måste ett stort antal sekvenser analyseras för att övervinna eventuella fördomar införs.

Här beskriver vi en alternativ experimentell lämpach lämplig för att studera sekvenser härledda från subtyp C akut infekterade individer. Vi använder ett restriktionsenzym baserad kloningsstrategi för att införa gag-genen från akuta punkter HIV-1 subtyp C infekterade individer infektions time in subtyp C proviral ryggrad, MJ4. Användningen av MJ4 som en gemensam ryggrad på sig att klona gag-gener är avgörande för analysen av subtyp C härledda sekvenser. MJ4 kommer från ett primärt isolat ^38, och därmed skulle vara mindre benägna att införa fördomar på grund av subtyp inkompatibilitet mellan ryggraden och gag-genen. Dessutom tillåter den strategi för att använda enzym baserad begränsning kloning för provirala konstruktioner som ska transfekteras direkt i 293T-celler, samt för indrivning av en klonal virus lager identisk med den klonade gag-sekvensen.

Metoden presenteras nedan är en hög genomströmning metod för bedömning replikeringskapacitet subtyp C härlett Gag-MJ4chimära virus. Transfektion in i 293T-celler är enkel och återvinning av virus tar bara tre dagar. In vitro replikering kapacitet analyseras på samma CEM-CCR5 baserade T-cellinje som skapats av Brockman et al. ^37, men med hjälp av viktiga protokoll modifieringar som behövs för att framgångsrikt replikering av subtyp C MJ4 chimära virus. Användningen av en lämplig T-cellinje stället PBMC möjliggör ett stort antal subtyp C MJ4-chimär virus som skall testas med hög analys reproducerbarhet. Slutligen, med hjälp av en radiomärkt omvänt transkriptas assay för kvantifiering av virus i supernatanten är mer kostnadseffektivt än att använda kommersiellt tillgängliga p24 ELISA-kit. Det ger också en högre dynamiskt omfång, vilket var viktigt för att upptäcka både dåligt och mycket replikerande virus inom samma analys och för att upptäcka subtila skillnader i replikering mellan isolat.

Sammanfattningsvis har metoden presenteras här tillåtet förden fördjupade studie av replikeringskapacitet gag sekvenser härledda från HIV-1 subtyp C akut infekterade individer från Zambia, och som skrivet, skulle också kunna utvidgas till att studera andra subtyp C smittade befolkningar. En hög grad av variation i replikeringskapacitet mellan olika Gag isolat observerades. Dessutom kunde vi visa ett statistiskt samband mellan replikeringskapacitet på den utsända Gag och börvärde virusmängd och med CD4 + nedgång under en treårsperiod ^39. Sådana resultat betona vikten av att studera hur överförd virus egenskaper, såsom replikering kapacitet, interagera med värdens immunsystem för att påverka patogenesen vid tidig infektion och kommer att vara integrerade för att utveckla effektiva vaccin interventioner samt behandling.