Bestemme både vert og viral egenskaper som påvirker HIV-1 patogenesen og sykdomsutvikling er viktig for rasjonell vaksine design. Den cellulære immunrespons er en viktig del av det menneskelige immunrespons mot HIV-1-infeksjon. Cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) som er nødvendig for den første kontroll av akutt viremi, og tillater verten for å etablere en stabil tilstand (settpunkt) virusmengde ^1,2. Eksperimentell uttømming av disse effektor-celler resulterer i tap av viral kontroll ^3,4. Til tross for dette, rømme mutasjoner oppstår i det virale genomet som grave CTL anerkjennelse av virusinfiserte celler ^5-9.

Visse HLA-alleler har vært forbundet med lavere virusmengde og tregere sykdomsutvikling inkludert B * 57, B * 27 og B * 81 ^10-15. En del av den beskyttende fordelen av HLA klasse I allelene kan tilskrives det faktum at de målrette funksjonelt begrenset regioner av genomet som for eksempel Gagog selektere for rømnings mutasjoner som reduserer evnen av viruset til å replikere in vitro ^16-21. Selv unnslippe fra det cellulære immunsystemet er fordelaktig for viruset i sammenheng med å velge HLA klasse I alleler, kan virkningen av disse mutasjonene har differensial konsekvenser for verten ved overføring til et HLA-umake individuelle ^22,23. Derfor vil forstå virkningene av overfør HLA-assosierte rømnings mutasjoner på viral replikasjon kapasitet være viktig for å fremme forståelsen av tidlig stadium av HIV-1-patogenesen.

Mens mye fremgang har blitt gjort for å identifisere og karakterisere trenings defekter av individuelle rømnings mutasjoner assosiert med spesifikke HLA klasse I alleler ^24-29, naturlig forekommende HIV-1-isolater har unike og komplekse fotavtrykk av HLA-assosierte polymorfismer, trolig som følge av HLA -mediert immun press forskjellige immunogenetic bakgrunn ^30. I aporrige analyse, Goepfert et al. viste at en akkumulering av HLA-assosierte mutasjoner i de overførte Gag sekvenser avledet fra 88 akutt infiserte Zambierne var assosiert med en reduksjon i settpunktet virusmengde ^31. Dette antydet at overføring av skadelige rømnings mutasjoner, spesielt i Gag, til HLA-umake mottakere gir en klinisk fordel, og kan skyldes attenuert virusreplikasjon. Fremover er det viktig å studere hvordan komplekse kombinasjoner av Gag polymorfismer innen naturlig forekommende isolater jobber sammen for å definere egenskapene til overført virus som replikasjonskapasitet, og hvor tidlig replikering kan i sin tur påvirke HIV-1 kliniske parametre og sent stadium patogenesen.

Brockman et al. Første gang påvist en sammenheng mellom replikasjonskapasitet av gag-pro sekvenser isolert ved kronisk stadium infeksjon og virusmengde i både subtype C og B-infeksjoner32-35. Den eksperimentelle metode presentert i disse studiene, men hensiktsmessig for behandlingen av in vitro replikasjonskapasitet av sekvenser avledet fra kronisk infiserte individer, har flere tekniske begrensninger og begrensninger som gjør studere HIV-1-replikasjonskapasitet i subtype C akutt infiserte individer vanskelig. Denne fremgangsmåte er avhengig av rekombinasjon av befolkningen basert PCR-amplifiserte sekvenser inn i subtype B NL4-3 provirus, som ble avledet delvis fra LAV, et laboratorium tilpasset virus lager ^36. Virus generasjonen ble oppnådd ved co-transfeksjon av en CEM-baserte T-cellelinje ³⁷ med PCR-amplikoner og fordøyd delta-gag-pro NL4-3 DNA. Denne metoden krever utvekst av virus over en periode på uker til måneder, potensielt forvrenger arten av den gjenvinnes virus lager i forhold til de virale quasispecies in vivo, og således endre måling av replikasjonskapasitet in vitro. Denne metoden jeger mer egnet for å studere kronisk infiserte individer, hvor den effektivt selekterer for virus med høyest replikative kapasitet, og hvor kloning rekke forskjellige virale varianter fra et stort antall av kronisk infiserte individer er ganske arbeidskrevende og derfor ikke er mulig. Imidlertid, innenfor en akutt infisert individ, er det vanligvis ett femtinitti varianter til stede, og dermed eliminere risikoen for å skråstille arten av den gjenvinnes virus lager, ved in vitro seleksjonstrykk, gir mulighet for en mer nøyaktig vurdering av in vitro replikasjonskapasitet. Dernest krever denne metoden recombining subtype C gag-pro sekvenser i en subtype B avledet ryggrad, og kunne introdusere ryggrad inkompatibilitet skjevheter i analysen. På grunn av disse begrensningene, må et stort antall sekvenser bli analysert for å overvinne eventuelle skjevheter innført.

Her beskriver vi en alternativ eksperimentell hensiktsach hensiktsmessig for å studere sekvenser avledet fra subtype C akutt infiserte individer. Vi bruker en begrensning enzym basert kloning strategi for å introdusere gag genet stammer fra akutt infeksjon tidspunkter av HIV-1 subtype C smittede personer inn i subtype C proviral ryggrad, MJ4. Bruken av MJ4 som et felles ryggraden i hvilken for å klone gener gag er avgjørende for analyse av undertype C-avledede sekvenser. MJ4 er avledet fra et primært isolat ^38, og dermed ville være mindre sannsynlighet for å innføre skjevhet på grunn av subtype inkompatibilitet mellom ryggraden og gag-genet. I tillegg er den tilnærming for å bruke enzymbasert restriksjons kloning gjør det mulig for proviral konstruerer å bli transfektert direkte inn i 293T-celler, og for gjenvinning av en klonal viruslager identisk med det klonede gag sekvens.

Metoden som presenteres nedenfor er en høy gjennomstrømning metode for vurdering av replikasjonskapasitet av subtype C avledet Gag-MJ4kimære virus. Transfeksjon inn i 293T-celler er enkel og gjenvinning av virus tar bare tre dager. In vitro replikasjonskapasitet blir analysert på samme CEM-CCR5 basert T-cellelinje som er laget av Brockman et al. ^37, men ved anvendelse av protokollen viktige modifikasjoner som er nødvendig for en vellykket replikering av subtype C MJ4 kimære virus. Bruken av et passende T-cellelinje i stedet for PBMC tillater et stort antall undertype C MJ4-kimære virus for å bli testet med høy analyse reproduserbarhet. Til slutt, ved å bruke en radioaktivt merket revers transkriptase assay for kvantifisering av virus i supernatanten er mer kostnadseffektivt enn å bruke kommersielt tilgjengelig P24 ELISA kit. Det gir også en høyere dynamisk område, som var viktig for å oppdage både dårlig og svært replikere virus innen samme analysen og for å avdekke små forskjeller i replikering mellom isolater.

Som konklusjon, har fremgangsmåten som presenteres her er tillatt forden inngående studie av replikasjonskapasitet av gag sekvenser avledet fra HIV-1 subtype C akutt infiserte individer fra Zambia, og som skrevet, kan også utvides til å studere andre subtype C smittet populasjoner. En høy grad av variasjon i replikering kapasiteter mellom ulike Gag isolater ble observert. I tillegg var vi i stand til å vise en statistisk sammenheng mellom replikasjonskapasitet av den overførte Gag og settpunkt virusmengde samt med CD4 + nedgang over en tre-års periode ^39. Slike resultater reke viktigheten av å studere hvordan overførte virale egenskaper, for eksempel replikasjonskapasitet, samhandle med vertens immunsystem til å påvirke patogenesen under tidlig infeksjon og blir integrert for å utvikle effektive vaksine inngrep så vel som behandling.