Bestimmung sowohl der Host und viralen Eigenschaften, die Einfluss auf HIV-1-Pathogenese und Progression der Erkrankung ist von größter Bedeutung für eine rationelle Impfstoff-Design. Die zelluläre Immunantwort ist eine Schlüsselkomponente der menschlichen Immunantwort auf HIV-1-Infektion. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) sind für die erste Kontrolle der akuten Virämie notwendig und erlauben dem Host, einen stabilen Zustand (Sollwert) die Viruslast ^1,2 etablieren. Experimentelle Erschöpfung dieser Effektor-Zellen führt zu einem Verlust der viralen Steuer ^3,4. Trotzdem entkommen Mutationen entstehen innerhalb des viralen Genoms, die CTL-Erkennung von virusinfizierten Zellen ^5-9 zu untergraben.

Bestimmte HLA-Allele wurden mit niedriger Viruslast und langsamer Fortschreiten der Krankheit, einschließlich B * 57, B * 27 und B * 81 ^10-15 in Verbindung gebracht. Teil der Schutzwirkung von HLA Klasse I-Allele können, daß sie funktional eingeschränkten Regionen des Genoms, wie Gag Ziel zurückzuführenund wählen Flucht Mutationen, die die Fähigkeit des Virus zur Replikation in vitro ^16-21 abnehmen. Obwohl Flucht aus dem zellulären Immunsystems ist vorteilhaft gegenüber dem Virus in Zusammenhang mit dem Auswahl HLA-Klasse-I-Allel kann die Wirkung dieser Mutationen Differenzfolgen für den Host bei der Übertragung zu einem HLA-übereinstimmende Einzel ^22,23 aufweisen. Daher, das Verständnis der Auswirkungen von übertragenen HLA-assoziierten Mutationen Flucht auf die virale Replikation Kapazität wird wichtig sein, um unser Verständnis der frühen HIV-1-Pathogenese zu fördern.

Während viele Fortschritte gemacht worden, Identifizierung und Charakterisierung der Fitness der einzelnen Defekte mit bestimmten HLA-Klasse-I-Allele ^24-29 verbunden Mutationen, natürlich vorkommende HIV-1-Isolate einzigartige und komplexe Spuren der HLA-assoziierten Polymorphismen, wahrscheinlich aus der HLA vermittelte Immun Druck von verschiedenen immungeneHinter ^30. In aprevious Analyse, Goepfert et al. zeigten, dass eine Ansammlung von HLA-assoziierte Mutationen in den übertragenen Gag-Sequenzen von 88 akut infizierten Zambians abgeleitet wurde, mit einer Verringerung der Sollviruslast ³¹ verbunden. Dies legte nahe, dass die Übertragung von schädlichen Mutationen, insbesondere in Gag, an HLA-übereinstimmende Empfänger einen klinischen Nutzen und können durch virale Replikation gedämpft werden. Moving forward, ist es zwingend notwendig, zu untersuchen, wie komplexe Kombinationen von Gag-Polymorphismen in natürlich vorkommenden Isolate im Konzert arbeiten, um Eigenschaften des Virus übertragen wie Replikation Kapazität und wie früh Replikation kann wiederum HIV-1-klinischen Parametern und Spätstadium beeinflussen definieren Pathogenese.

Brockman et al. Eine Verbindung zwischen den Replikationskapazität von gag-pro-Sequenzen während der chronischen Phase der Infektion und Viruslast in beiden Subtyp C und B-Infektionen isoliert erstmals gezeigt32-35. Der experimentelle Ansatz in diesen Studien vorgestellt, obwohl geeignete für die Prüfung der in vitro Replikation Kapazität von Sequenzen aus chronisch infizierten Personen stammen, hat mehrere technische Vorbehalte und Einschränkungen, die das Studium machen HIV-1-Replikationskapazität in Subtyp C akut infizierten Personen schwierig. Dieses Verfahren beruht auf der Rekombination von Bevölkerungs basierten PCR-amplifizierten Sequenzen in den Subtyp B NL4-3 Provirus, die teilweise von LAV, abgeleitet wurde, angepasst, ein Laborvirusvorrat ^36. Viruserzeugung wurde durch Co-Transfektion einer CEM-basierte T-Zelllinie mit ³⁷ PCR-Produkte durchgeführt und aufgeschlossen Delta-gag-pro NL4-3 DNA. Dieses Verfahren erfordert das Auswachsen von Virus über einen Zeitraum von Wochen bis Monate, möglicherweise Neigen der Art des gewonnenen Virus Lager in Bezug auf die virale Quasi-Spezies in vivo und somit zur Änderung der Messung der Replikationsfähigkeit in vitro. Diese Methode, die ichist mehr für die Untersuchung chronisch infizierten Individuen, wenn sie tatsächlich selektiert Virus mit der höchsten Replikationsfähigkeit, und wo die Klonierung zahlreichen verschiedenen Virusvarianten aus einer großen Anzahl von chronisch infizierten Personen angemessen ist sehr arbeitsintensiv und daher nicht durchführbar ist. Jedoch in einer akut infizierten Individuum gibt es im allgemeinen ein zwei Varianten vor, und wodurch das Risiko einer Schrägstellung der Art des gewonnenen Virus-Stock, durch in vitro Selektionsdruck erlaubt eine bessere Beurteilung der in vitro-Replikationskapazität. Zweitens erfordert dieses Verfahren Rekombination Subtyp C-Gag-pro-Sequenzen in einem Subtyp B abgeleitet Rückgrat und könnte Rückgrat Inkompatibilität Vorurteile in die Analyse einzuführen. Aufgrund dieser Einschränkungen ist eine große Anzahl von Sequenzen, um mögliche Verzerrungen eingeführt überwinden analysiert werden.

Hier beschreiben wir eine alternative Versuchs approach für das Studium Sequenzen aus Subtyp C akut infizierten Individuen abgeleitet angemessen. Wir verwenden eine Restriktionsenzym-basierte Klonen Strategie, um die gag-Gen von einer akuten Infektion Zeitpunkte der HIV-1 Subtyp C infizierten Personen in den Subtyp C proviraler Rückgrat, MJ4 abgeleitet einzuführen. Die Verwendung von MJ4 als gemeinsames Grundgerüst, in dem gag-Gene zu klonieren ist für die Analyse von Subtyp C abgeleitete Sequenzen. MJ4 ist aus einem primären Isolat ³⁸ abgeleitet, und somit wäre weniger wahrscheinlich, Verzerrung durch Subtyp Inkompatibilität zwischen dem Backbone und gag-Gen einzuführen. Darüber hinaus ist die Ansatz der Verwendung von Enzym-basierte Klonen Einschränkung erlaubt die proviralen Konstrukte direkt in 293T-Zellen transfiziert werden, und für die Wiederherstellung eines klonalen Virus-Stamm identisch mit dem geklonten gag-Sequenz.

Die nachstehenden Verfahren ein Hochdurchsatzverfahren zur Bewertung der Replikationsfähigkeit des Subtyps C abgeleitet Gag-MJ4chimären Viren. Transfektion in 293T-Zellen ist einfach und Virusgewinnung erfolgt nur drei Tage. In vitro Replikationskapazität auf demselben CEM-CCR5 basierend T-Zell-Linie, die durch Brockman et al untersucht. ^37, aber unter Verwendung von für die erfolgreiche Replikation notwendig wichtiges Protokoll Modifikationen des Subtyps C MJ4 chimären Viren. Die Verwendung einer geeigneten T-Zell-Linie anstatt PBMCs ermöglicht eine große Anzahl von Subtyp C MJ4-chimären Viren mit hoher Reproduzierbarkeit Assay getestet werden. Schließlich, unter Verwendung einer radioaktiv markierten Reverse-Transkriptase-Assay zur Quantifizierung von Virus im Überstand ist kostengünstiger als die Verwendung von kommerziell erhältlichen p24-ELISA-Kits. Es gibt auch einen höheren Dynamikumfang, die wichtig zur Erkennung beide schlecht und sehr replizierende Viren innerhalb der gleichen Assay zum Nachweis und feine Unterschiede in der Replikation zwischen Isolaten war.

Im Ergebnis hat das hier vorgestellte Verfahren zur gestattetDie eingehende Untersuchung der Replikationskapazität von gag-Sequenzen von HIV-1 Subtyp C abgeleitet akut infizierten Personen aus Sambia und wie geschrieben, könnte auch erweitert werden, um andere Subtyp C infiziert Populationen zu untersuchen. Ein hohes Maß an Variation in der Replikation zwischen verschiedenen Kapazitäten Gag Isolate beobachtet. Darüber hinaus waren wir in der Lage, eine statistische Assoziation zwischen der Kapazität der Replikation übertragen Gag und Sollwert der Viruslast als auch mit CD4 + Rückgang über einen Zeitraum von drei Jahren ³⁹ zeigen. Solche Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Untersuchung, wie tragene Viruseigenschaften, wie Replikationskapazität, die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts zu Pathogenese während der frühen Infektion beeinflussen und Integral für die Entwicklung wirksamer Impfstoff Interventionen als auch die Behandlung sein.