Bestemme både vært og virale karakteristika, der påvirker HIV-1 patogenese og sygdomsudviklingen er altafgørende for en rationel vaccine design. Det cellulære immunrespons er et centralt element i indsatsen mod hiv-1-infektion menneskelige immunsystem. Cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) er nødvendige i den indledende kontrol af akut viræmi og tillade værten at etablere en stabil tilstand (setpunkt) virusbelastning ^1,2. Eksperimentel udtømning af disse effektorcellerne resulterer i tab af viral kontrol ^3,4. På trods af dette, flygte mutationer opstår i det virale genom, der undergrave CTL anerkendelse af virusinficerede celler ^5-9.

Visse HLA-alleler er blevet forbundet med lavere virale belastninger og langsommere sygdomsprogression, herunder B * 57 B * 27 og B * 81 ^10-15. En del af den beskyttende fordel af HLA klasse I alleler kan tilskrives det faktum, at de er målrettet mod funktionelt begrænsede områder af genomet, såsom Gagog vælge efter escape mutationer, der reducerer evnen af virusset til at replikere in vitro ^16-21. Selv flygte fra det cellulære immunsystem er gavnlig for virus i forbindelse med valg HLA klasse I allel, kan virkningen af disse mutationer har differentierede konsekvenser for værten ved overførsel til en HLA-mismatchede individuel ^22,23. Derfor vil forstå effekten af ​​transmitterede HLA-associerede escape mutationer på viral replikation kapacitet være vigtigt at fremme vores forståelse af tidlig hiv-1 patogenese.

Selvom der er gjort store fremskridt for at identificere og karakterisere fitness defekter af enkelte kvitterede mutationer forbundet med specifikke HLA klasse I-alleler ^24-29, naturligt forekommende HIV-1-isolater har unikke og komplekse fodspor af HLA-associeret polymorfier, sandsynligvis som følge af HLA medieret immun tryk forskellige immunogenetisk baggrunde ^30. APorrige analyse Goepfert et al. viste, at en akkumulering af HLA-associerede mutationer i de transmitterede Gag sekvenser afledt fra 88 akut inficerede Zambianerne blev associeret med en reduktion i setpunkt viral belastning ^31. Dette antydede, at overførslen af ​​skadelige kvitterede mutationer, specielt i Gag, at HLA-uoverensstemmende modtagere giver en klinisk fordel, og kan skyldes svækket viral replikation. Bevæger sig fremad, er det bydende nødvendigt at undersøge, hvordan komplekse kombinationer af Gag polymorfier indenfor naturligt forekommende isolater arbejder i fællesskab for at definere karakteristika for den transmitterede virus såsom replikation kapacitet, og hvor tidligt replikation kan til gengæld påvirke HIV-1 kliniske parametre og sen-fase patogenese.

Brockman et al. Først påvist en sammenhæng mellem replikation kapacitet gag-Pro sekvenser isoleret under kronisk fase infektion og viral belastning i både subtype C og B-infektioner32-35. Den eksperimentelle tilgang, der præsenteres i disse undersøgelser, selv om det er relevant for behandlingen af in vitro-replikation kapacitet sekvenser afledt af kronisk inficerede individer, har flere tekniske forbehold og begrænsninger, der gør studerer HIV-1 replikationskapacitet i undertype C akut inficerede individer vanskelig. Denne metode bygger på rekombination af befolkningen baserede PCR-amplificerede sekvenser i undertype B NL4-3 proviruset, der blev afledt dels fra LAV, et laboratorium tilpasset virus lager ^36. Virus generation blev opnået ved co-transfektion af en CEM-baserede T-celle linie ³⁷ med PCR amplikoner og fordøjet deltace- gag-pro NL4-3 DNA. Denne metode kræver, at udvækst af virus over en periode på uger til måneder, hvilket potentielt skråstilling arten af det udvundne virus lager i forhold til den virale quasispecies in vivo og derfor ændring af måling af replikation kapacitet in vitro. Denne metode Ier mere egnet til at studere kronisk inficerede individer, hvor det effektivt vælges for virus med den højeste replikative kapacitet, og hvor kloning mange forskellige virusvarianter fra et stort antal af kronisk inficerede individer er ganske arbejdskrævende og derfor ikke er mulig. Men inden for en akut inficeret individ, der generelt 1-2 varianter til stede, og dermed eliminere risikoen for skråstilling arten af det udvundne virus lager gennem in vitro selektionstryk, giver mulighed for en mere nøjagtig vurdering af in vitro-replikation kapacitet. For det andet kræver denne metode rekombinerer subtype C gag-Pro sekvenser i en undertype B afledt rygrad, og kunne indføre backbone uforenelighed bias i analysen. På grund af disse begrænsninger, må et stort antal sekvenser analyseres med henblik på at overvinde eventuelle fordomme indført.

Her beskriver vi en alternativ eksperimenterende hensigtsver egnet til at studere sekvenser afledt fra subtype C akut inficerede individer. Vi bruger et restriktionsenzym baseret kloning strategi om at introducere gag-gen afledt af akut infektion tidspunkter af HIV-1 subtype C inficerede individer i subtype C provirale rygrad, MJ4. Anvendelsen af MJ4 som en fælles rygrad til at klone gag generne er afgørende for analysen af subtype C afledte sekvenser. MJ4 er afledt fra et primært isolat ^38, og således ville være mindre tilbøjelige til at indføre bias som følge af undertype inkompatibilitet mellem rygraden og gag-genet. Hertil kommer, at tilgang til brug baseret begrænsning kloning enzym tillader den provirale konstruktioner, der skal transficeres direkte ind i 293T-celler og til genopretning af en klonal virusstamme identisk med den klonede gag-sekvensen.

Den præsenteres nedenfor metoden er en high throughput metode til at vurdere replikation kapacitet af subtype C afledt Gag-MJ4kimæriske vira. Transfektion i 293T-celler er ligetil og inddrivelse af virus tager kun tre dage. In vitro-replikation kapacitet analyseres på samme CEM-CCR5 baseret T-celle linie skabt af Brockman et al. ^37, men ved hjælp af vigtige protokol ændringer er nødvendige for en vellykket replikation subtype, K MJ4 kimære virus. Brugen af ​​et passende T-celle linie snarere end PBMC'er giver mulighed for et stort antal subtype C MJ4-kimære virus, der skal testes med høj analyse reproducerbarhed. Endelig, ved hjælp af et radioaktivt mærket revers transkriptase-assay til kvantificering af virus i supernatanten er mere omkostningseffektiv end ved anvendelse af kommercielt tilgængelige p24 ELISA kits. Det giver også en højere dynamikområde, som var vigtigt for at detektere både dårligt og stærkt replikerende virus inden for samme analyse og til påvisning af subtile forskelle i replikation mellem isolater.

Konklusionen er, at den metode, der præsenteres her tilladt forden grundige undersøgelse af replikation kapacitet gag-sekvenser afledt fra HIV-1 subtype C akut inficerede individer fra Zambia, og som skrevet, kan også udvides til at studere andre undertype C inficerede befolkninger. Blev observeret en høj grad af variation i replikation kapacitet mellem forskellige Gag isolater. Desuden var vi i stand til at vise en statistisk sammenhæng mellem replikation kapacitet transmitterede Gag og indstille punkt viral belastning samt med CD4 + tilbagegang over en tre-årig periode ^39. Sådanne resultater understreger vigtigheden af ​​at studere, hvordan transmitterede virale egenskaber, såsom replikation kapacitet, interagere med værtens immunsystem til at påvirke patogenese under tidlig infektion og vil være integreret for at udvikle effektiv vaccine indgreb samt behandling.