Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva<em> In Situ</em> Ibridazione in larvale Sea Lamprey
Summary
Lamprede recuperare locomozione dopo una lesione completa del midollo spinale. Tuttavia, alcuni neuroni spinali-proiezione sono buoni recuperatori e altri non lo sono. Questo documento illustra le tecniche per la lampreda di mare abitazioni larve (e adulti recentemente trasformati), producendo completi transezioni midollo spinale e la preparazione di cervelli wholemount e midolli spinali per l'ibridazione in situ.
Abstract
Dopo una lesione completa del midollo spinale, lamprede di mare in un primo momento sono paralizzate sotto il livello di resezione. Tuttavia, essi recuperano locomozione dopo diverse settimane, e questo è accompagnato da rigenerazione breve distanza (pochi mm) degli assoni propriospinali e degli assoni spinali-proiezione dal tronco encefalico. Tra i 36 grandi neuroni spinali-proiezione identificabili, alcuni sono buoni recuperatori e gli altri sono cattivi rigeneratori. Questi neuroni possono essere più facilmente identificate nelle preparazioni SNC wholemount. Al fine di comprendere i meccanismi dei neuroni-intrinseca che favoriscono o inibiscono la rigenerazione degli assoni dopo una lesione nei vertebrati del SNC, si determina differenze di espressione genica tra i rigeneratori buoni e cattivi, e come l'espressione è influenzata dalla resezione del midollo spinale. Questo documento illustra le tecniche per l'edilizia abitativa larvale e recentemente trasformato lamprede di mare per adulti in serbatoi d'acqua dolce, producendo completi transezioni midollo spinale sotto visione microscopica, e preparare brain e wholemounts midollo spinale per ibridazione in situ. In breve, gli animali sono mantenuti a 16 ° C e anestetizzato in 1% benzocaina in lampreda Ringer. Il midollo spinale è sezionato con iridectomia forbici attraverso un approccio dorsale e l'animale è permesso di recuperare in serbatoi d'acqua dolce a 23 ° C. Per ibridazione in situ, gli animali sono reanesthetized e il cervello e il cavo rimosso tramite un approccio dorsale.
Introduction
Nei mammiferi lesioni del midollo spinale (SCI) è una condizione devastante che porta alla perdita permanente della funzione al di sotto del sito di lesione, perché assoni feriti non si rigenerano attraverso la zona di trauma e ricollegare ai loro obiettivi adeguati. A differenza dei mammiferi, lamprede recuperare locomozione dopo una lesione completa del midollo spinale. 1 È interessante notare che, lamprede hanno una serie di 36 midollo spinale proiettando neuroni che sono singolarmente identificabili in tutto il montaggio preparati cervello a causa delle loro grandi dimensioni 2,3 (Figura 1) . Tutti questi neuroni spinali-proiezione sono axotomized da un alto livello completa resezione del midollo spinale. Precedenti studi del nostro gruppo e altri hanno dimostrato che anche in presenza di recupero funzionale dopo SCI alcuni di questi neuroni mostrano una bassissima capacità rigenerativa (sono considerati "cattivi rigeneratori"), mentre altri di solito si rigenerano il loro assone attraverso il sito di lesione (sono considerati "grigeneratori OOD "). 2,3 Questa caratteristica rende lamprede un modello vertebrato interessante studiare le differenze nell'espressione genica tra il bene e il male rigeneratori neuroni spinali-proiezione, che a sua volta porterà alle differenze nella capacità rigenerativa intrinseca dei neuroni che cercano di rigenerare i loro assoni nello stesso ambiente estrinseca. 1
Usando questo modello che abbiamo precedentemente dimostrato che il midollo-proiezione neuroni con scarsa capacità rigenerativa spettacolo espressione di recettori guida assonale molecola come UNC5 4,5 e neogenin, 6 che mediano rispettivamente, l'azione inibitoria di netrina e RGM. Inoltre, con questo metodo il nostro gruppo ha anche dimostrato che solo le buone rigeneratori mostrano un recupero dell'espressione di neurofilamenti dopo la lesione e durante il processo di rigenerazione. Recentemente, Busch e Morgan 7 hanno dimostrato mediante immunofluorescenza che i cattivi rigeneratori mostrano un Incremed espressione di sinucleina dopo l'infortunio, che è stato riferito da autori al fatto che i "cattivi" rigeneratori neuroni spinali-proiezione lentamente muoiono dopo una completa del midollo spinale recisione 5,7,8. Così, il modello lampreda di una lesione completa del midollo spinale è emerso come un modello molto utile per capire che cosa rende un cordone sporgente neurone spinale un "cattivo rigeneratore" dopo assotomia.
Per condurre i nostri studi si sta eseguendo un protocollo di intervento chirurgico completo midollo spinale resezione e una dissezione del cervello posteriore in corrispondenza dei punti di tempo desiderato dopo l'infortunio di eseguire wholemount ibridazione in situ. Nell'articolo metodologica presente vi presentiamo un protocollo dettagliato per la corretta esecuzione di un intervento chirurgico completo lesioni del midollo spinale in lamprede larvale, la successiva manutenzione degli animali e la dissezione del cervello finale e preparazione del cervello per un wholemount ibridazione in situ. Un protocollo dettagliato per perform il wholemount ibridazione in situ nel cervello di lamprede larvale è stato riportato in precedenza. 9 Inoltre, questo protocollo per le lesioni del midollo spinale e la dissezione del cervello può essere utilizzato anche per poi elaborare i cervelli per immunoistochimica o altri metodi istologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per eseguire una resezione completa del midollo spinale e posteriore dissezione del cervello in lamprede di mare larvali. Questa procedura permette di analizzare le differenze nell'espressione genica tra identificabile midollo spinale sporgenti neuroni dopo la lesione del midollo spinale per mezzo di un cervello intero-mount ibridazione in situ. Il passaggio fondamentale nella procedura è la corretta esecuzione di una resezione completa del midollo spinale, che può esse…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Antón Barreiro-Iglesias was supported by the Fundación Barrié (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
Referências
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