A determinação quantitativa de reações bioquímicas fornece insights sobre os processos biológicos a base da vida. Calorimetria oferece uma metodologia livre de etiqueta para caracterizar quantitativamente praticamente todas as reações químicas em solução. Esta técnica mede o calor libertado ou absorvido ao longo do tempo, e é, portanto, um sistema de detecção universal e uma metodologia muito conveniente para quantificar a quantidade de moléculas de reacção de ligação (ou seja, a termodinâmica), bem como para medir a velocidade da reacção (isto é, a cinética). Em particular, calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi adotado como método de escolha para caracterizar a termodinâmica dos equilíbrios biomoleculares, envolvendo proteína-ligante, proteína-proteína, proteína-íons metálicos e interações DNA-proteína ^1-6. Além disso, a capacidade de ITC para fornecer informação cinética faz com que seja um sistema poderoso para medir a catálise da enzima, embora o potencial desta aplicação é aindasubestimado ^7-9.

A equação de Michaelis-Menten ^{de 10} é uma descrição quantitativa das reacções enzimáticas, uma vez que proporciona uma relação entre a velocidade de reacção e a concentração do substrato, dependendo de dois parâmetros cinéticos: a constante de Michaelis (K _M) e a constante de velocidade catalítica _(kcat) . O _kcat / K _M é referida como a eficiência catalítica de uma enzima. Na prática, a determinação de K _M e K _cat para uma reacção específica proporciona uma descrição completa da catálise.

Numa reacção típica enzimática (Figura 1), um substrato (S) interage com a enzima (E), formando o complexo enzima-substrato (ES), que é subsequentemente activado no estado de transição (ES *). O último é convertido no complexo enzima-produto (PE) que, eventualmente, se dissocia. Estes passos são descritos através da reacção seguinte.

(1)

onde k é _uma constante de velocidade para a formação do complexo ES, k _-1 é a constante de velocidade da dissociação do complexo ES, enquanto _kcat é a constante de velocidade catalítica ou número de turnover.

De acordo com a equação de Michaelis-Menten ^{de 10,} a taxa da reacção pode ser calculado como:

(2)

em que _M = K _{(k-1 +} k _cat) / k ₁ e k _cat = _Vmax / [E], com v _max sendo a velocidade máxima atingida quando todos enzima é ligada ao substrato.

O calorímetro de titulação isotérmica é o instrumento utilizado neste estudo para caracterizar a hidrólise enzimática de ureia. Este instrumento é feito de um escudo adiabático contendo duas pilhas em forma de cunhadas (Figura 1). Estas estão ligadas ao lado de fora, com tubos de acesso estreitas. A célula da amostra (cerca de 1,4 ml) é carregado com a solução de enzima, enquanto que a célula de referência é geralmente cheia com água ou com o solvente usado para a análise. Uma seringa de rotação com uma agulha comprida e uma pá de agitação ligado, geralmente contendo ca. 0,3 ml de solução de substrato, é montada na célula de amostra. Um dispositivo termoeléctrico mede a diferença de temperatura entre a amostra e a célula de referência e, usando uma "rede de realimentação da célula", que mantém esta diferença a zero pela adição ou subtracção de calor. Durante o ensaio, o substrato é injectado na solução de enzima a uma temperatura escolhida constante. Quando o enzymatic reacção tem lugar, a quantidade de calor libertada ou absorvida é proporcional ao número de moléculas de substrato que são convertidos em moléculas do produto. Além disso, a taxa de fluxo de calor está directamente relacionada com a velocidade da reacção. Os dados medidos, aparecendo como um desvio de calor a partir do traçado da linha de base inicial (Figura 1), representam a energia térmica (μcal / seg) fornecido pelo aparelho para a célula de amostra, que é proporcional ao fluxo de calor que ocorre na célula de amostra ao longo do tempo.

Figura 1. Representação esquemática do calorímetro de titulação isotérmica para estudar as reacções enzimáticas. Uma reacção enzimática que ocorre na titulação do substrato (na seringa de injecção), para a solução de enzima (na célula de amostra) resulta em uma mudança da terapmal poder liberado pelo calorímetro, necessário para manter a diferença de temperatura entre a célula de amostra e a constante da célula de referência. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Em geral, a troca de calor (Q) é proporcional à entalpia molar da reacção (AH) e o número de moles de produto gerado (n), que por sua vez é determinado pelos tempos totais de volume da concentração:

(3)

A formação do produto ao longo do tempo (dP / dt), o que corresponde à velocidade da reacção, pode, assim, ser relacionado com a quantidade de calor gerado durante o mesmo tempo (dQ / dt), através da relação:

(4)

De acordo com esta equação, a fim de se obter um lote de Michaelis-Menten, é necessário medir i) o total AH entalpia molar, e ii) o fluxo de calor dQ / dt, em diferentes concentrações de substrato. Geralmente, isto é realizado em duas experiências diferentes: na primeira experiência (Método 1, M1), o substrato é injectado na solução de enzima e do calor para a conversão completa do substrato é medida; na segunda experiência (Método 2, M2), injecções múltiplas de substrato são realizados e a taxa de produção de calor é medido em diferentes concentrações de substrato. Estes dois conjuntos de dados são suficientes para derivar os parâmetros cinéticos K _M e k _cat.

No presente artigo, um protocolo geral para determinar os parâmetros cinéticos de reações enzimáticas realizadas utilizando ITC é descrito. O método foi aplicado a hidrólise da uréia por Canavalia ensiformis uréiase, como um sistema de referência. A boa concordância entre os resultados obtidos através deste método e os dados relatados na literatura demonstra a confiabilidade desta abordagem.