Sıcak Biyolojik kataliz: İzotermal Titrasyon Kalorimetre enzimatik reaksiyonların Characterize
Summary
Izotermal titrasyon kalorimetre önlemler ısı akışı serbest veya kimyasal reaksiyonlarda absorbe. Bu yöntem, enzim katalizi ölçmek için kullanılabilir. Bu yazıda, enstrümantal kurulumu için protokol, deneme çalışan ve veri analizi genel olarak anlatılmıştır, ve jack fasulye üreazla enzimatik üre hidroliz karakterizasyonu uygulanır.
Abstract
Izotermal titrasyon kalorimetre (ITC) ısı hemen hemen her kimyasal süreci karakterize etmek için içsel bir prob olarak kullanarak, kimyasal bir reaksiyon esnasında salınan veya emilen ölçen iyi tanımlanmış bir tekniktir. Günümüzde, bu teknik kapsamlı bağlama biyomoleküler termodinamik denge parametreleri belirlemek için uygulanır. Buna ek olarak, bu uygulama ITC doğrudan hala yeterince faydalanılmayan olduğu halde, enzimatik reaksiyonların kinetik ve termodinamik parametreleri (k cat, K E, AH) ölçüm yapabilmek için gösterilmiştir. Isı değişiklikler kendiliğinden enzim katalizi sırasında meydana geldiğinde, ITC analiz edilen sistemin herhangi bir değişiklik ya da etiketleme gerektirmez ve çözelti içinde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, yöntem malzemenin az miktarda ihtiyaç duyar. Bu özellikler ITC gibi çeşitli uygulamalar, örneğin, ilaç keşfi enzim kinetiğinin araştırılması için, paha biçilmez güçlü ve benzersiz bir araç yapmak.
<p cbu çalışmada kinetik ve enzimatik reaksiyonların termodinamik ölçmek için deneysel bir itc-tabanlı yöntem olarak lass ="jove_content"> iyice açıklanmıştır. Bu yöntem, k cat belirlemek için uygulanır ve Canavalia ensiformis (jack bean) üreaz tarafından enzimatik üre hidrolizinin K M. Reaksiyonun içsel molar entalpisi (AH int) hesaplanması gerçekleştirilir. Bu şekilde elde edilen değerler, metodolojisinin güvenilirliğini gösteren, literatürde bildirilen daha önceki veriler ile tutarlıdır.Introduction
Biyokimyasal reaksiyonların kantitatif tayini hayatın temelinde biyolojik süreçlere bakış sağlar. Kalorimetre kantitatif çözelti içinde hemen hemen her kimyasal reaksiyon karakterize etmek için bir etiket içermeyen bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, ısı serbest ya da zaman içinde absorbe ölçer ve bu nedenle evrensel bir algılama sistemi ve reaksiyona moleküllerin (örneğin bağlanma termodinamik) yanı sıra, bu, reaksiyon oranını (yani kinetik) ölçmek için miktarını ölçmek için çok uygun bir yöntemdir. Özellikle, izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) protein-ligand, protein-protein, protein-metal iyonları ve protein-DNA etkileşim 1-6 dahil, biyomoleküler dengenin termodinamik karakterize etmek için tercih edilen bir yöntem olarak kabul edilmiştir. Bu uygulamanın potansiyel hala olmasına rağmen ek olarak, kinetik bilgi sağlamak için ITC yeteneği, bu enzim katalizi ölçmek için çok güçlü bir sistem yapar7-9 hafife.
Michaelis sabiti (K M) ve katalitik oranı sabiti (k cat): iki kinetik parametrelere bağlı olarak, reaksiyon hızı ve alt tabaka konsantrasyonu arasında bir ilişki sağlayan olarak Michaelis-Menten denklemi 10, enzimatik reaksiyonların kantitatif açıklaması . K cat / K oranı, M, bir enzimin katalitik verimlilik olarak adlandırılır. Uygulamada, belirli bir reaksiyon için K M belirlenmesi ve k kedi kataliz tam bir açıklamasını sağlar.
Tipik bir enzimatik reaksiyon (Şekil 1) olarak, bir alt-tabaka (S) daha sonra geçiş durumuna aktif enzim-alt-tabaka (ES) kompleks oluşturucu enzim (E), (ES *) ile etkileşime girer. Ikinci sonunda ayrışmaktadır enzim ürünü (EP) kompleksi haline dönüştürülür. Bu adımin aşağıdaki reaksiyon ile açıklanmıştır.
(1)
k, 1 ES kompleksi, k -1 oluşumu için oran sabit olduğu k cat katalitik oranı sabit ya da devir sayısı iken, ES kompleksinin ayrışma için oran sabitidir.
: Michaelis-Menten denklemine 10 göre, reaksiyonun oranı olarak hesaplanabilir
(2)
burada K M = (k + -1 k cat) / k 1 ve k cat = v max / [E], v max tüm enzim alt-tabakaya bağlı olduğunda, ulaşılan maksimum hızı olmak üzere.
Izotermal titrasyon kalorimetre üre enzimatik hidrolizi karakterize etmek için, bu çalışmada kullanılan bir araçtır. Bu cihaz iki icat şeklinde hücreleri (Şekil 1) ihtiva eden bir adiyabatik kalkanı yapılır. Bu dar giriş boruları ile dışarıdan bağlanır. Referans hücre, genellikle su ile ya da analiz için kullanılan çözücü ile dolu iken numune hücresi (yaklaşık 1.4 mi), enzim solüsyonu ile yüklenir. Genellikle alt-tabaka çözeltisi ca. 0.3 ml ihtiva eden bir uzun iğne ve bağlı bir karıştırma kürek ile dönen bir şırınga, numune hücresi üzerine monte edilir. Bir termoelektrik cihaz "hücre geribildirim ağı" kullanarak, örnek ve referans hücre arasındaki sıcaklık farkını ölçer, ısı eklenerek veya çıkarılarak sıfırdan bu farkı tutar. Deney esnasında, alt-tabaka sabit bir seçilen sıcaklıkta enzim çözeltisi içine enjekte edilir. Ne zaman trzymatic Reaksiyon serbest veya emilen ısı miktarı ürün moleküllerine dönüştürülür alt-tabaka moleküllerinin sayısı ile orantılıdır, gerçekleşir. Buna ek olarak, ısı akış oranının doğrudan reaksiyonun hızı ile ilgilidir. Ölçülen veriler, başlangıç bazal ısı iz bir sapma (Şekil 1) olarak görülen, (μcal / saniye) numune hücresinin meydana gelen ısı akışı ile orantılıdır numune hücresinin, için cihaz tarafından verilen ısı gücü temsil zaman içinde.
Şekil 1. Enzimatik reaksiyonları incelemek için izotermal titrasyon kalorimetre şematik temsili. (Örnek hücre olarak) Ther bir değişiklik ile sonuçlanır enzim çözeltisi içine (enjeksiyon şırınga içinde), substratın üzerine titre oluşan bir enzimatik reaksiyon,örnek hücre ve referans hücre sabiti arasındaki sıcaklık farkı tutmak için gerekli kalorimetre tarafından yayımlanan mal güç. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Genel olarak, ısı değişim (Q) reaksiyonu (AH) ve sırayla toplam hacim kat konsantrasyonu verilir (n), üretilen ürünün mol sayısının molar entalpisi ile orantılıdır:
(3)
Ürün oluşumu, zaman içinde, reaksiyon hızına karşılık gelen (dP / dt), böylece, ilişki ile aynı zamanda (dQ / dt) üzerinden oluşan ısı miktarı ile ilişkili olabilir:
(4)
Bu denkleme göre, Michaelis-Menten elde etmek amacıyla it) toplam moler entalpisi AH i ölçmek için gerekli olan arsa ve değişik alt tabaka konsantrasyonunda ii) ısı akışı dQ / dt. Genellikle, bu, iki farklı deney yapılır: ilk deneyde (Yöntem 1, M1) olarak, alt-tabaka enzim çözeltisi içine enjekte edilir ve tam dönüşüm için alt-tabaka ısı ölçülür; İkinci deneyde (Yöntem 2, M2), alt-tabakanın birden çok enjeksiyon yapılmaktadır ve ısı üretim oranı, çeşitli substrat konsantrasyonlarında ölçülmüştür. Bu iki veri setleri kinetik parametreleri K, M ve k cat elde etmek için yeterlidir.
Bu makalede, ITC kullanılarak gerçekleştirilmiştir enzimatik reaksiyonlar için kinetik parametrelerinin belirlenmesi için genel bir protokol tarif edilmektedir. Biz Canavalia ensiformis üre üre hidroliz yöntemi uygulananse, bir referans sistemi olarak. Bu yöntem kullanılarak elde edilen sonuçları ve literatürde bildirilen veriler arasında iyi bir uyum, bu yaklaşımın güvenilirliğini gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut yöntemlere göre enzimatik aktivitesini incelemek için ITC önemi
Bağlama dengeleri incelemek için klasik uygulamalara ek olarak, izotermal titrasyon kalorimetrisi sistem modifikasyon veya etiketleme gerektirmeden, bir prob olarak reaksiyon ısısının kullanılarak çözelti içinde enzimatik reaksiyonları karakterize için güvenilir ve hızlı bir yöntem sağlar. Kinetik parametreler kedi k ve K M genellikle ürün for…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Özel Gübre Ürünleri Şirketi (SFP) Bu çalışma için gerekli fonları sağlamak için kabul edilmektedir.
Materials
| HEPES | Sigma | H3375 | dissolving in water and adjusting pH with NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | dissolving in water and adjusting pH with HCl |
| Sodium dihydrogen phosphate | Riedel-de-Haen | 4270 | dissolving in water |
| Sodium phosphate dibasic | Riedel-de-Haen | 30427 | dissolving in water |
| Urea | Sigma | U4128 | dissolving in water at 40 °C |
| Canavalia ensiformis urease (type C-3) | Sigma | U0251 | dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C |
| VP-ITC on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | instrument |
| VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | data acquisition software supplied with the instrument |
Referências
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
- Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques. 37, 885-887 (2004).
- Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR. Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).
- Zambelli, B., et al. High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter. J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J. Vis. Exp. , (2011).
- Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research–survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
- Todd, M. J., Gomez, J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity. Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).
- Bianconi, M. L. Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions. Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).
- Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).
- Michaelis, L., Menten, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).
- Walker, J., Wilson, K., Walker, J. . Principle and techniques of practical biochemistry. , 312-356 (2000).
- Ciurli, S., Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. . Nickel and its surprising impact in nature. 2, 241-278 (2007).
- Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis. Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).
- Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds. Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).
- Follmer, C. Insights into the role and structure of plant ureases. Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).
- Sumner, J. B. The isolation and crystallization of the enzyme urease. J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).
- Krajewska, B. Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review. J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).
- Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. The burden borne by urease. J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).
- Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).
- Hausinger, R. P., Karplus, P. A., Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. . Handbook of Metalloproteins. , 867-879 (2001).
- Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).
- Baumann, M. J., et al. Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays. Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).
- Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).
- Harmon, K. M., Niemann, C. The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate. J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).
- Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).
- Segel, I. H. . Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. , (1993).
