Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish
Summary
Dopo la sezione spinale, zebrafish adulto ha recupero funzionale da sei settimane post-infortunio. Per usufruire di trasparenza larvale e recupero più veloce, vi presentiamo un metodo per sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, osserviamo il recupero sensoriale che inizia a 2 giorni dopo l'infortunio, e il movimento C-bend per tre giorni post-infortunio.
Abstract
Mammiferi sicuro nel recupero sensoriale e motoria seguente lesione del midollo spinale per mancanza di ricrescita assonale sotto del livello della lesione e l'incapacità di reinizializzare neurogenesi spinale. Tuttavia, alcuni Anamni tra cui il zebrafish Danio rerio mostre sia sensoriali e recupero funzionale anche dopo la completa resezione del midollo spinale. Lo zebrafish adulto è un organismo modello stabilito per studiare la rigenerazione dopo la lesione del midollo spinale, con recupero sensoriale e motorio da 6 settimane post-infortunio. Per usufruire di analisi in vivo del processo rigenerativo disponibile in zebrafish larvale trasparente così come strumenti genetici non accessibile nell'adulto, usiamo il zebrafish larvale di studiare la rigenerazione dopo resezione del midollo spinale. Qui mostriamo un metodo per riproducibile e verificabile sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, dai dati risulta recupero sensoriale inizio a due giorni post-infortunio (dpi), with il movimento di C-bend rilevabile da 3 dpi e la ripresa di nuoto libero da 5 dpi. Così proponiamo zebrafish larvale come strumento guidata al zebrafish adulti per lo studio di recupero dopo lesione del midollo spinale.
Introduction
Grave trauma al midollo spinale umano si traduce spesso in paralisi permanente e perdita di sensibilità al di sotto del livello della lesione, a causa della incapacità di ricrescere assoni o iniziare nuovamente neurogenesi 1,2. In contrasto con i mammiferi, tuttavia, Anamni tra cui salamandre e zebrafish (Danio rerio) mostrano robusta ripresa anche dopo la completa del midollo spinale recisione 3,4.
Lo zebrafish adulto è un modello ben consolidato per studiare il processo di recupero dopo lesione del midollo spinale 5-7. Dopo resezione completa del midollo spinale, ripristino della funzione sensoriale e locomotiva è osservata nel zebrafish adulto per 6 settimane post-infortunio 8. Al fine di esaminare il processo di rigenerazione in vivo, ci siamo rivolti al zebrafish larvale trasparente 9.
Qui vi presentiamo un metodo per transetto midollo spinale di un 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) larvale zebrafish USIng una pipetta microiniezione smussato come un bisturi, modificato da Bhatt, et al. 10 Questo metodo supporta throughput elevato, bassa mortalità e riproducibilità. Con la pratica, 300 larve / h può essere sezionato, e oltre 6 mesi di transections, di cui oltre 3.600 animali, 98,75% ± 0,72% sopravvisse entro 7 giorni post-infortunio (dpi). I nostri dati mostrano un rapido recupero di locomozione sensoriale e così: a 1 dpi, tutti i movimenti dai pesci feriti è guidata da un solo pettorale locomozione pinna. Tuttavia, le larve iniziano a rispondere al tungsteno ago tocco caudale a resezione del 2 dpi, ristabilire il movimento C-bend da 3 dpi, e visualizzare il nuoto predatori del 5 dpi 11. Utilizzando la colorazione anticorpi contro tubulina acetilata, abbiamo confermato che gli assoni sono assenti dal sito di lesione a 1 dpi, ma abbiamo attraversato il sito di lesione da 5 dpi. Crediamo che questo protocollo fornirà una valida tecnica per lo studio di ricrescita assonale e neurogenesi nel midollo spinale dopo la lesione. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Quando inizialmente imparare questa tecnica, si consiglia di tentare non più di 50-100 transections in una singola sessione. Dopo aver imparato questa tecnica, siamo in grado di transetto fino a 300 embrioni per ora; Tuttavia, questo livello di velocità richiede pochi mesi di pratica settimanale. Consigliamo inoltre praticare con una linea giornalista e la verifica completa resezione finché l'incidenza di incompleta recisione del midollo spinale è ridotto a meno dell'1%.
Recision…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo in debito con l'impianto University of Utah zebrafish per la zootecnia. RID è stato sostenuto da NIH R56NS053897, e LKB era un tirocinante predoctoral supportato dall'iniziativa HHMI Med-Into-Grad.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 ga. needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
| micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1L) | store at RT | ||
| 17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
| 0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1L) | store at RT | ||
| 50ml 20x E2 | |||
| 2ml fresh 500x NaCO3 |
Referências
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