Summary
GABAergic presynaptic निषेध मोटर और रीढ़ की हड्डी नेटवर्क में संवेदी संकेत एकीकरण के लिए महत्वपूर्ण रीढ़ की हड्डी में एक शक्तिशाली निरोधात्मक तंत्र है. अंतर्निहित प्राथमिक अभिवाही विध्रुवण पृष्ठीय रूट क्षमता (DRP) की रिकॉर्डिंग से मापा जा सकता है. यहाँ हम चूहों में DRP के vivo रिकॉर्डिंग की एक विधि का प्रदर्शन.
Abstract
Presynaptic निषेध रीढ़ की हड्डी में सबसे शक्तिशाली निरोधात्मक तंत्र में से एक है. अंतर्निहित शारीरिक तंत्र GABAergic AXO-axonal synapses (प्राथमिक अभिवाही विध्रुवण) द्वारा मध्यस्थता प्राथमिक अभिवाही फाइबर का एक विध्रुवण है. प्राथमिक अभिवाही विध्रुवण की ताकत पृष्ठीय रूट (पृष्ठीय रूट क्षमता, DRP) में मात्रा आयोजित क्षमता की रिकॉर्डिंग से मापा जा सकता है. Presynaptic निषेध के रोग परिवर्तन कुछ दर्द की स्थिति के असामान्य सेंट्रल प्रोसेसिंग में और मोटर hyperexcitability के कुछ विकारों में महत्वपूर्ण हैं. यहाँ, हम चूहों में vivo में रिकॉर्डिंग DRP की एक विधि का वर्णन. anesthetized जानवर और चूषण इलेक्ट्रोड का उपयोग रिकॉर्डिंग प्रक्रिया में रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय जड़ों की तैयारी व्याख्या कर रहे हैं. इस विधि GABAergic DRP मापने और इस तरह रहने वाले चूहे में रीढ़ की presynaptic निषेध का आकलन की अनुमति देता है. ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के साथ संयोजन में, DRP रिकॉर्डिंग मई एसईरोग जुड़े रीढ़ की pathophysiology की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में RVE. में vivo रिकॉर्डिंग जैसे एक साथ रिकॉर्डिंग या supraspinal नेटवर्क और परिधीय नसों की उत्तेजना से DRP के शामिल होने की गड़बड़ी की संभावना पूर्व vivo पृथक रीढ़ की हड्डी की तैयारी, की तुलना में कई फायदे हैं.
Introduction
Presynaptic निषेध रीढ़ की हड्डी में सबसे शक्तिशाली निरोधात्मक तंत्र में से एक है. यह postsynaptic झिल्ली क्षमता और motoneurons 1-3 के excitability बदलने के बिना monosynaptically उत्साहित motoneurons में उत्तेजक postsynaptic क्षमता (EPSPs) को रोकता है. संवेदी presynaptic फाइबर पर GABAergic AXO-axonal synapses द्वारा प्रेरित प्राथमिक अभिवाही विध्रुवण (पैड) अंतर्निहित तंत्र 4-7 (भी Figure1A देखें) है. इन synapses GABA एक और GABA बी रिसेप्टर्स (GABA एक अनुसंधान और GABA बी आर) होते हैं. GABA एक आर गतिविधि के कारण स्थानीय आयन वितरण के लिए पैड elicits जो क्लोराइड प्रवाहकत्त्व में वृद्धि हो जाती है. इस विध्रुवण ब्लॉक अक्षतंतु टर्मिनलों में कार्रवाई क्षमता के प्रसार और एक कम 2 सीए के प्रमुख के लिए उनकी ताकत कम कर देता है + बाढ़ और ट्रांसमीटर रिहाई की कमी. GABA बी रिसेप्टर्स की सक्रियण करता है कोईटी पैड के लिए योगदान लेकिन जिससे presynaptic निषेध बढ़ाने सीए 2 + बाढ़ की कमी आती है. GABA एक अनुसंधान की सक्रियता लघु अवधि के निषेध में शामिल किया जा रहा है, GABA बी आर लंबी अवधि मॉडुलन 8-10 में शामिल रहे हैं. पैड और presynaptic निषेध का प्रमुख हिस्सा लिए खातों GABA, के अलावा, अन्य ट्रांसमीटरों सिस्टम भी मिलाना सकता है और इस तंत्र 11,12 करने के लिए योगदान करते हैं.
Presynaptic निषेध में रोग परिवर्तन, दोषपूर्ण GABAergic प्रसारण 17 से मध्यस्थता मोटर hyperexcitability साथ परिधीय सूजन और न्यूरोपैथिक दर्द 13,14, साथ ही असामान्य केंद्रीय दर्द प्रसंस्करण 15, रीढ़ की हड्डी में चोट के 16, और सीएनएस रोग जैसे कई रोग राज्यों में महत्वपूर्ण होने लगते हैं 18. इस प्रकार, presynaptic निषेध का आकलन vivo में रीढ़ की हड्डी के स्तर पर प्रयोगात्मक रोग की स्थिति की जांच करने के लिए सार्थक है 7 की उत्तेजना के बाद रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय जड़ों से मापा जा सकता है.
DRP की पहली माप बिल्लियों और मेंढ़कों 19 में सूचित किया गया है और अधिकता 1970 के दशक 3,4,20,21 में Eccles, श्मिट, और दूसरों के द्वारा बिल्लियों में अध्ययन किया गया. बिल्लियों के 22 और चूहों 23 में DRP के vivo रिकॉर्डिंग व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, चूहों में माप लगभग विशेष रूप से पूर्व vivo पृथक रीढ़ की हड्डी की तैयारी 15,24 में प्रदर्शन किया गया है. यहाँ, हम बरकरार जीव में presynaptic निषेध का एक सीधा उपाय की अनुमति विवो में anesthetized चूहों में DRP रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि का वर्णन.
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं थ्युरिनजियन राज्य के अधिकारियों (थुरिंगर Landesamt फर Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12) द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. प्रयोग के लिए तैयारी
- चूषण इलेक्ट्रोड का निर्माण
- उदाहरण के लिए एक मानक पैच इलेक्ट्रोड एक micropipette खींचने के साथ एक मानक borosilicate ग्लास केशिका का उपयोग कर एक micropipette खींचो.
- ब्रेक एक हीरा फ़ाइल का उपयोग (पृष्ठीय जड़ों के व्यास से थोड़ा बड़ा) 0.5-1 मिमी व्यास टिप करने के लिए इलेक्ट्रोड.
- हीट पोलिश यह एक मानक प्रयोगशाला मशाल अंदर चूसा है जब यह पृष्ठीय रूट को नुकसान नहीं होगा तो टिप उपयुक्त हो जाएगा.
- नकारात्मक दबाव लागू किया जा सकता है जिसके माध्यम से एक सिरिंज से जुड़ा एक इलेक्ट्रोड धारक पर कांच रेशा माउंट.
- समाधान की तैयारी
- चूहों के लिए इंजेक्शन संज्ञाहरण: 0.75 मिलीलीटर ketamine 10% मिक्स, 0.24 मिलीग्राम xylazine 2% एकएन डी 5 मिलीलीटर 0.9% खारा. समाधान के 10 μl / छ वजन (BW) (आईपी) intraperitoneally इंजेक्शन जाएगा.
- कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF):; KCl 3, के.एच. 2 पीओ 4 1.25, 4 MgSO • एच 2 ओ 2, 3 NaHCO 25, 2 CaCl 2, डी NaCl 134: दोहरा आसुत जल में (मिमी) निम्नलिखित लवण पतला 10 ग्लूकोज. 0.003% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एच 2 2 हे जोड़ें. हमेशा हौसले से तैयार समाधान का प्रयोग करें.
- रिकॉर्डिंग सेटअप की तैयारी (चित्रा 2)
- डेटा अंकीयकरण के लिए एक पीसी अंतरफलक को एम्पलीफायर से कनेक्ट करें.
- पीसी हार्ड ड्राइव पर एक वर्ग पल्स उत्तेजक और डाटा अधिग्रहण को गति प्रदान करने के लिए एक पीसी आधारित कार्यक्रम या एक एनालॉग टाइमर का प्रयोग करें.
- उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के लिए मानक के रूप में कांच इलेक्ट्रोड धारकों से जुड़े chlorided silverwires का प्रयोग करें.
- एक Stere के आसपास क्रमशः उत्तेजना, रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए तीन manipulators इकट्ठाचूहों के लिए otactic फ्रेम, सभी इलेक्ट्रोड पर बाद में तैयार रीढ़ की हड्डी के लिए उपयोग किया है, ताकि.
- नकारात्मक दबाव लागू करने के लिए सेब होने के लिए इलेक्ट्रोड धारकों के लिए tubings और सीरिंज कनेक्ट करें.
2. पशु प्रयोगों और रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के लिए पशु तैयारी के लिए सामान्य टिप्पणियां
- संबंधित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों का उपयोग सभी प्रयोगों प्रदर्शन. पशु पीड़ा को कम से कम सुनिश्चित करना है कि गहरी संज्ञाहरण के तहत सभी सर्जरी और रिकॉर्डिंग प्रदर्शन.
- (; ऊपर वर्णित के रूप में तैयार समाधान के 10 μl / छ BW क्रमशः 125mg और ketamine और xylazine, के जी BW प्रति 8mg) ketamine / xylazine के आईपी इंजेक्शन द्वारा पशु anesthetize. लंबे समय तक रिकॉर्डिंग के दौरान यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त इंजेक्शन आईपी या IM बनाया जा सकता है
नोट: 0.05-0.1 का दोहराव आईएम इंजेक्शन ऊपरी जांघों में ketamine / xylazine समाधान के मिलीलीटर उपयुक्त साबित कियाऊपर से 3 घंटे के लिए गहरी संज्ञाहरण में पशु रखने के लिए. - संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें.
- एक stereotactic फ्रेम में पशु के सिर फिक्स और प्रयोग के दौरान पशु के शरीर के तापमान को नियंत्रित करने के लिए गुदा जांच और पलटा लूप के साथ एक हीटिंग पैड का उपयोग करें. एक stereotaxic फ्रेम में रीढ़ की हड्डी का निर्धारण आवश्यक नहीं है.
- तैयारी शुरू करने से पहले, चूहों की उंगलियों के बीच eyeblink पलटा और हिल द्वारा निद्रावहन की गहराई की जांच. सजगता समाप्त कर दिया जाना चाहिए.
- एक छुरी का उपयोग कर एक स्पष्ट परिचालन क्षेत्र पाने के लिए काठ क्षेत्रों को कम करने के लिए ऊपरी वक्ष स्तर से रीढ़ की हड्डी के ऊपर midline के साथ त्वचा को खोलें. त्वचा चीरों बनाने के लिए कैंची का उपयोग न करें. ध्यान से अंतर्निहित ऊतक से त्वचा ढीली. बाद के चरणों में 0.9% खारा से सिक्त घाव रखने के दौरान.
- छुरी और कैंची का उपयोग tendons और वक्ष के स्तर को काठ से कशेरुकाओं के दोनों ओर संयोजी ऊतक में कटौती. एक छोटे चिमटा का उपयोग कशेरुकाओं के आसपास spinous प्रक्रियाओं और संयोजी ऊतक के बाकी निकालें.
- ध्यान चिमटा एक विदारक खुर्दबीन के नीचे काठ का स्तर (L4/L5) से शुरू करने के साथ कशेरुकाओं दरार. कशेरुकाओं और रीढ़ की हड्डी के बीच अंतरिक्ष में जापानी की नोक भगाओ और अलग हड्डी के टुकड़े उठा. ड्यूरा नुकसान और रीढ़ की हड्डी को दबाव से बचने मत करो. दोनों सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं. पूरी प्रक्रिया के दौरान सिक्त रीढ़ की हड्डी रखें. मध्य वक्ष के स्तर के लिए आगे बढ़ें.
3. पृष्ठीय जड़ें और DRP रिकॉर्डिंग की अलग करना (चित्रा 2)
- ध्यान से एक तुला टिप के साथ एक पतली सुई (30 ग्राम) का उपयोग ड्यूरा मेटर खोलें. अब से moistening के लिए aCSF का प्रयोग करें.
- गेज का उपयोग जहाँ तक संभव हो पृष्ठीय जड़ों अलग है और संभव के रूप में बाहर के रूप में दो आसन्न जड़ों से काट दिया. जोरदार जुदाई के दौरान जड़ों पर खींच प्रयोग की सफलता को प्रभावित करता है.
- Do लिए चूषण इलेक्ट्रोड नीचे कमजड़ों rsal. तरल पृष्ठीय जड़ों में चूसना करने में मदद करता है क्योंकि संभव के रूप में रीढ़ की हड्डी के रूप में ज्यादा aCSF जोड़ें.
- एक सिरिंज के माध्यम से नकारात्मक दबाव लागू करने से एक गिलास pipettes में एक पृष्ठीय रूट की कटौती अंत चूसो. यदि आवश्यक हो, एक ठीक सुई का उपयोग कर इलेक्ट्रोड उद्घाटन के सामने पृष्ठीय रूट चाल है.
- पृष्ठीय रूट चूषण इलेक्ट्रोड के अंदर शुष्क है तो पिपेट पर्याप्त aCSF से भर जाता है जब तक ध्यान से चूसने जबकि, इसकी टिप करने के लिए कुछ aCSF जोड़ें.
- पृष्ठीय रूट में चूसा है, के बाद रीढ़ की हड्डी से इलेक्ट्रोड टिप बढ़ा. ध्यान रखना कि पिपेट टिप और रीढ़ की हड्डी में शॉर्ट सर्किट रिकॉर्डिंग / उत्तेजना इलेक्ट्रोड के बीच कोई "पानी पुल".
- दोहराएँ एक ipsilateral आसन्न रूट के लिए 3.3-3.6 कदम.
- पृष्ठीय जड़ों के लिए संभव के रूप में करीब संदर्भ इलेक्ट्रोड स्थिति और aCSF लगाने से सिक्त रहते हैं.
- रिकॉर्डिंग सेटअप की स्थापना करके, एक रूट पहले से ही उत्तेजना के लिए चुना जाता है,रिकॉर्डिंग के लिए अन्य. दूसरा पृष्ठीय रूट से रिकॉर्डिंग वर्तमान दबाना मोड में किया जाता है, जबकि वोल्टेज stepwise बढ़ाएँ. एक DRP का प्रतिनिधित्व एक धीमी, लंबे समय से स्थायी ऊपर की ओर नीचे को झुकाव द्वारा पीछा किया जाता है, जो एक छोटी नीचे विक्षेपन देख सकते हैं.
- (- 0.1 हर्ट्ज पर 30 sweeps / पृष्ठीय रूट, 0.3 हर्ट्ज-3 kHz के बीच फिल्टर कम से कम 20) के स्तर supramaximal और कई sweeps रिकॉर्ड करने के लिए प्रोत्साहन वोल्टेज समायोजित.
- DRP के समय पर निर्भर योग के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए तीन उत्तेजनाओं (100 हर्ट्ज) की छोटी गाड़ियों रिकार्ड.
- अतिरिक्त contralateral रिकॉर्डिंग के लिए रिकॉर्डिंग और उत्तेजना साइट स्विच.
- पशु प्रक्रिया जीवित करने का इरादा नहीं है. जबकि अभी भी गहरी संज्ञाहरण के तहत (ketamine / xylazine, ऊपर देखें 2.2 कदम) कत्ल के द्वारा पिछली रिकॉर्डिंग के बाद जानवरों को बलिदान.
4. डेटा विश्लेषण
- विश्लेषण कार्यक्रम के लिए डेटा स्थानांतरण (जैसे सिग्मा प्लॉट, इगोर प्रो, या Matlab).
- औसत निशान fr की गणनाओम 20-30 बने.
- आगे के विश्लेषण के लिए (चित्रा 3), (DRP शिखर आयाम आधारभूत से) वोल्टेज नीचे को झुकाव की अधिकतम आयाम ले लो.
- बाद में क्षमता के समय निर्भर योग का एक उपाय हासिल करने के लिए तीन दालों और भी नाड़ी के बाद DRP शिखर आयाम के अनुपात की गणना.
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Representative Results
ठेठ DRP निशान चित्रा 3 में दिखाया गया. प्रमुख उत्तेजना विरूपण साक्ष्य आमतौर पर एक छोटी नीचे विक्षेपन द्वारा पीछा किया जाता है. इसके बाद DRP का प्रतिनिधित्व एक धीमी, लंबे समय से स्थायी ऊपर की ओर नीचे को झुकाव, स्पष्ट रूप से अलग पहचाना है. रिकॉर्डिंग के एक सबसेट में, पृष्ठीय रूट सजगता DRP के शीर्ष पर छोटे spikes के रूप में दिखाई दे रहे हैं. उत्तेजना वोल्टेज अत्यधिक है जब सामान्य जंगली प्रकार चूहों में, पृष्ठीय रूट सजगता सबसे अक्सर दिखाई देते हैं. पृष्ठीय रूट सजगता इस तैयारी में एक उच्च reproducibility के साथ हासिल नहीं किया जा सकता है, वे विश्लेषण के लिए नहीं लिया गया और देखभाल सबसे कम करने के लिए उत्तेजना वोल्टेज कम करने के लिए लिया गया था, लेकिन अभी भी supramaximal ताकत. DRP शिखर आयाम के विश्लेषण के लिए, 20-30 बाद sweeps के निशान (चित्रा 3 ए) का इस्तेमाल कर रहे हैं औसत. DRP शिखर आयाम पूर्व उत्तेजना विरूपण साक्ष्य के लिए आधारभूत स्तर की तुलना में गणना की जा सकती.
DRP के समय पर निर्भर योग दोहराए सेंट से विश्लेषण किया जा सकता हैimulations (3 उत्तेजनाओं, 100 हर्ट्ज, चित्रा 3 बी). शिखर आयाम एकल उत्तेजना प्रयोग के अनुसार गणना की है. उच्च आवृत्ति पर एक एकल और तीन stimulations के बाद आयाम के अनुपात पैड के समय पर निर्भर योग के एक अनुमान देता है.
चित्रा 1. पैड से जुड़े रीढ़ की हड्डी रास्ते और रिकॉर्डिंग सेटअप के योजनाबद्ध चित्र. एक. चित्र एक पृष्ठीय रूट की उत्तेजना के बाद रीढ़ की हड्डी में presynaptic निषेध की योजनाबद्ध मार्ग दिखाता है (3). प्राथमिक अभिवाही विध्रुवण (पैड) पहली आदेश न्यूरॉन्स (1) और आइए अभिवाही फाइबर (2) पर एक AXO-axonal synapse के साथ एक निरोधात्मक interneuron द्वारा लगातार GABAergic निषेध का एक पूल के सक्रियण के माध्यम से मध्यस्थता है. पृष्ठीय रूट क्षमता (डीआरपी), पैड प्रतिबिंबित पृष्ठीय रूट साथ इलेक्ट्रॉनिक रूप से फैला है और रीढ़ की हड्डी (4). बी करने के लिए अपनी प्रविष्टि के पास दर्ज किया गया. डाटा अधिग्रहण एक LIH 8 +8 कंप्यूटर इंटरफेस का उपयोग करते हुए एक निजी कंप्यूटर चल रहा है patchmaster सॉफ्टवेयर (1) द्वारा किया जाता है (2). ELC यूनिवर्सल एम्पलीफायर से वोल्टेज संकेत (7) 10 kHz पर डिजीटल हैं. उत्तेजना एक S88 दोहरी निर्गम वर्ग पल्स उत्तेजक नियंत्रित एक टीटीएल संकेत से शुरू हो रहा है (3). वोल्टेज दालों एक चूषण इलेक्ट्रोड के माध्यम से लागू कर रहे हैं (4). रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक preamplifier से जुड़ा है (6). एक chlorided चांदी के तार (5) ग्राउंडिंग के लिए प्रयोग किया जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2.बगल में DRP रिकॉर्डिंग. एक. anesthetized माउस की रीढ़ की हड्डी ड्यूरा मेटर हटा, उजागर, और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव के साथ सिक्त है. चूषण इलेक्ट्रोड (1: इलेक्ट्रोड उत्तेजक, 2: इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग) रीढ़ की हड्डी पर तैनात हैं. इनसेट रीढ़ की हड्डी (काला तीर) और पृष्ठीय जड़ों (नीले तीर) से पता चलता है. पृष्ठीय जड़ों में कटौती, अलग, और इलेक्ट्रोड (1,2). बी के सुझावों में ले लिया. वे आसपास के तरल पदार्थ के साथ संपर्क में नहीं हैं कि इतनी पृष्ठीय जड़ों (इनसेट, पीले तीर) युक्त pipettes के टिप्स, ध्यान से रीढ़ की हड्डी की सतह से ऊंचा किया जाना है. पृष्ठीय जड़ों की टूटती और रीढ़ की हड्डी को छू (ए और बी: उत्तेजना इलेक्ट्रोड 1; रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड 2; संदर्भ इलेक्ट्रोड 3) से बचा जाना चाहिए. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. प्रतिनिधि परिणाम है. पृष्ठीय जड़ों की एक जोड़ी से 28 लगातार निशान (सही पैनल) की एक. औसतन रिकॉर्डिंग (बाएं पैनल). उत्तेजना विरूपण साक्ष्य (1) DRP जो दर्शाता है (ऊपर 2,) एक लंबे समय तक नकारात्मक संभावित, द्वारा पीछा किया जाता है. कुछ रिकॉर्डिंग में, दिल की धड़कन (ईसीजी) एक artifact (सही पैनल, लाल तीर) के रूप में देखा जाता है, लेकिन स्पष्ट रूप से DRP से भेदभाव किया जा सकता है. DRP को आरोपित ओवरलैपिंग ईसीजी कलाकृतियों के साथ निशान विश्लेषण. बी से बाहर रखा जाना है. दोहराए उत्तेजना (3 उत्तेजनाओं, 10 हर्ट्ज). सी. DRP का उदाहरण रिकॉर्डिंग (काला लाइन) से पहले और 5 मिनट के बाद (भुज अस्थायी योग स्पष्ट करने के लिए बढ़े हुए है) DRP की एक समय पर निर्भर योग की ओर जाता है स्थानीय (लाल रेखा)उजागर रीढ़ की हड्डी पर GABAergic अवरोधक bicucullin (0.5 मिमी, 500 μl) के आवेदन. स्थानीय GABAergic interneurons के अवरुद्ध (कभी कभी कभी कभी विवो रिकॉर्डिंग में DRP के दौरान होता है और जो लाल वक्र में 50 हर्ट्ज साइन लहर के विरूपण साक्ष्य ध्यान दें उचित द्वारा भी रोका नहीं जा सकता दर्ज की क्षमता के GABAergic मूल की पुष्टि DRP शिखर आयाम का एक उल्लेखनीय गिरावट की ओर जाता है ग्राउंडिंग और परिरक्षण).
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Discussion
Vivo में neuronal गतिविधि और synaptic क्षमता के अतिरिक्त और intracellular electrophysiological रिकॉर्डिंग सीएनएस neuronal कार्यों और pathophysiology की जांच में अत्याधुनिक तकनीक हैं. रीढ़ की हड्डी में एकीकरण मोटर समारोह, जैसे अंग आंदोलन के लिए और बहुविध संवेदी धारणा के लिए महत्वपूर्ण है. Presynaptic निषेध संवेदी आदानों के लिए उपयुक्त प्रतिक्रिया सुनिश्चित इस कम्प्यूटेशनल प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण तंत्र है. आइए अभिवाही फाइबर पर GABAergic synapses पैड से motoneurons की उत्तेजना को बाधित. विवो में पृष्ठीय रूट संभावित रिकॉर्डिंग सीधे बरकरार जानवर में पैड को मापने के लिए संभावना को खोलता है. इस तकनीक असामान्य रीढ़ की हड्डी में निषेध ऐसे दर्द, रीढ़ की हड्डी की चोट, परिधीय तंत्रिका चोट, या सूजन के रूप में प्रासंगिक है, जिसमें रोग राज्यों से संबंधित अनुसंधान के लिए विशेष रुचि का हो सकता है. आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल के उपयोग के साथ संयोजन में इस तकनीक inve के लिए शक्तिशाली हो सकता हैstigate तंत्र रीढ़ की हड्डी में निषेध परेशान अंतर्निहित. यहां विधि पृथक रीढ़ की हड्डी की तैयारी का उपयोग चूहों में DRP रिकॉर्डिंग के विकल्प के रूप में कुछ सीमाओं पर काबू. तो, supraspinal नेटवर्क के लिए रास्ते संरक्षित और भी रीढ़ की हड्डी और supraspinal neuronal गतिविधि का संयुक्त विश्लेषण संभव है कर रहे हैं. पैड पर supraspinal गतिविधि का असर संबंधित मस्तिष्क केन्द्रों के समानांतर बिजली की उत्तेजना के द्वारा जांच की जा सकती है. इसके अलावा, DRP परिधीय तंत्रिका घाव या सूजन के पशु मॉडल में प्रासंगिकता की हो सकती है, जो सीधे परिधीय तंत्रिका की उत्तेजना के द्वारा पैदा किया जा सकता है. उचित संज्ञाहरण, सतर्कता और तापमान नियंत्रण का प्रयोग, रिकॉर्डिंग शारीरिक शर्तों के तहत बरकरार जानवर में घंटे के लिए किया जा सकता है.
कुछ स्नान के नियंत्रित स्थानीय दवा आवेदन और छिड़काव के बारे में सीमित विस्तार करने के लिए इसके विपरीत, पृथक रीढ़ की हड्डी की तैयारी के उपयोग की तुलना में, DRP के vivo रिकॉर्डिंग है तोlution. ड्रग्स topically लागू किया जा सकता है लेकिन वजह से आसपास के ऊतकों में अनिश्चित प्रसार करने के लिए, रिकॉर्डिंग तैयारी में चर समाधान विनिमय और समाधान की राशि यह रीढ़ की हड्डी और रिकॉर्डिंग साइट के भीतर दवा एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए संभव नहीं है. सतह आवेदन की तीव्र प्रभाव का अध्ययन कर रहे हैं, इन सीमाओं को आंशिक रूप से pipettes के माध्यम से स्थानीय आवेदन के द्वारा हल किया जा सकता है.
चूहों की रीढ़ की हड्डी में छोटा है, दबाव और मरोड़ करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील, और सर्जरी के लिए मुश्किल है. इसलिए, vivo इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए माउस रीढ़ की हड्डी की तैयारी कुछ प्रशिक्षण की जरूरत है. कुछ महत्वपूर्ण बातें हैं. यह तैयारी के दौरान ड्यूरा मेटर नुकसान पहुंचाया और बेहतर नहीं है या कम से कम बहुत कुछ दबाव रीढ़ की हड्डी को लागू किया जाता है कि नहीं है कि आवश्यक है. रीढ़ की हड्डी में रखा क्रमश: पहले और NaCl और aCSF साथ ड्यूरा के उद्घाटन के बाद, पूरी प्रक्रिया के दौरान सिक्त किया जाना चाहिए. शोर करने के लिए संकेतDRP रिकॉर्डिंग के अनुपात संबंधित पृष्ठीय रूट के प्रवेश बिंदु के लिए संभव के रूप में बंद उत्तेजक और रिकॉर्डिंग से बढ़ाया जा सकता है. रिकॉर्डिंग सेटअप के मेहनती ग्राउंडिंग और परिरक्षण unspecific शोर को कम करने में मदद करता है, विच्छेदन खुर्दबीन के लैंप बंद कर दिया या रिकॉर्डिंग के दौरान हटा दिया जाना चाहिए.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.
Acknowledgments
हम विधि की स्थापना के दौरान उपयोगी विचार विमर्श के लिए मैनफ्रेड Heckmann धन्यवाद. इसके अलावा, हम वीडियो उत्पादन समर्थन के लिए तकनीकी सहायता और फ्रैंक Schubert के लिए क्लाउडिया Sommer धन्यवाद. 01EO1002 और जेना विश्वविद्यालय अस्पताल की क्लीनिकल रिसर्च के लिए अंतःविषय केंद्र (IZKF): काम संघीय शिक्षा मंत्रालय और अनुसंधान (BMBF), जर्मनी, FKZ द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamine 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30 G Microneedle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Universal amplifier | NPI (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
References
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