Expression hétérologue et purification du régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) sont des défis importants et les facteurs limitants dans le développement de thérapies pour la fibrose kystique. Ce protocole décrit deux méthodes pour l'isolement de quelques milligrammes de CFTR appropriés pour des études fonctionnelles et structurelles.
Irrégularités dans le régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) protéines provoquent la fibrose kystique (FK), une maladie autosomique récessive qui limite actuellement l'espérance de vie moyenne des personnes atteintes de <40 ans. Le développement de nouvelles molécules de médicaments à restaurer l'activité de la protéine CFTR est un objectif important dans les FC de traitement, et l'isolement de la protéine CFTR fonctionnellement active est une étape utile pour atteindre cet objectif.
Nous décrivons deux méthodes pour la purification de la protéine CFTR à partir d'un système d'expression hétérologue eucaryote, S. cerevisiae. Comme les systèmes procaryotes, S. cerevisiae peut être cultivée rapidement dans le laboratoire à faible coût, mais peut également le trafic et post-traductionnelle modifier grosses protéines membranaires. La sélection des détergents pour la solubilisation et la purification est une étape critique dans la purification de toute protéine de la membrane. Ayant examiné pour la solubilité de la protéine CFTR dans plusieurs détergents, nous avons choisi deux contrasting détergents pour utilisation dans la purification qui permettent la préparation finale de la protéine CFTR à être adaptée par la suite aux expériences envisagées.
Dans ce procédé, nous proposons des comparaisons de la purification de la protéine CFTR dans le dodécyl-β-D-maltoside (DDM) et de 1-tétradécanoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (LPG-14). Protéine purifiée dans DDM par cette méthode présente une activité ATPase dans des essais fonctionnels. La protéine purifiée dans le GPL-14 montre une grande pureté et le rendement, peuvent être employés pour étudier les modifications post-traductionnelles, et peut être utilisé pour les méthodes structurelles telles que la diffusion aux petits angles des rayons X et par microscopie électronique. Cependant, il présente une activité d'ATPase significativement plus faible.
La fibrose kystique (FK) est la maladie génétique la plus répandue en Europe et en Amérique du Nord avec une incidence d'environ 1 à 2500 naissances vivantes. Se produit quand CF mutations dans le régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) cause la protéine de perte de sa fonction à la membrane plasmique des cellules épithéliales 1. La conséquence la plus grave de ce défaut est dommage irréversible des poumons, ce qui raccourcit l'espérance de vie des personnes souffrant de <40 ans de 2,3 ans.
CFTR est une cassette (ABC) transporteur ATP-binding qui a évolué pour devenir un 1,4 de canal ionique. En dépit de sa fonction tout à fait altéré dans la membrane plasmique des cellules, elle conserve encore une homologie de séquence significative avec d'autres transporteurs ABC. Curieusement, les parties spécialisées du CFTR (sa région réglementaire et son N-et C-terminales) partagent aucune similarité de séquence significative avec d'autres métazoaires transporteurs ABC, donc il n'y a pas d'indices que pour ee origines de ces séquences dans la protéine CFTR. Sur la base de sa structure primaire, la protéine CFTR est classé comme un membre de la famille C-de la famille des transporteurs ABC, mais il n'existe pas de preuves solides pour une liaison fonctionnelle résiduelle de cette sous-famille. Il ya eu des rapports d'activité de transport de glutathion pour CFTR 5-7, ce qui serait compatible avec les rôles des autres membres du C-famille 8,9, bien que d'autres rapports suggèrent que le glutathion réduit peut inhiber l'activité CFTR ATPase, plutôt que de montrer la stimulation induite par le substrat qui caractérisent les transporteurs ABC 10. La mesure de la conductance d'ions est suffisamment sensible pour permettre à l'activité de canal de molécules CFTR simples à étudier 1 et les propriétés du canal CFTR a été surveillée en fonction du temps, de la température, de la concentration de l'ATP, du potentiel de membrane, et de l'état de phosphorylation, comme dans le présence d'une multitude de petites molécules inhibitrices, des potentialisateurs et des modificateurs. Cesétudes ont également ajouté de manière significative à notre connaissance du fonctionnement des transporteurs ABC. Néanmoins, l'expression de la protéine CFTR dans des quantités significatives et sa purification ultérieure s'est avérée particulièrement difficile et le succès a été limité à quelques laboratoires 10-13.
La nécessité de développer des médicaments plus efficaces est criante, mais ce processus a été entravé par le manque de CFTR purifié pour le criblage de petites molécules. Résoudre le problème de l'expression de la protéine CFTR et la purification permettrait le dépistage des drogues à haut débit visant à corriger le défaut primaire dans les FC et aussi ouvrir une route pour des études structurales à haute résolution pour informer la conception rationnelle de médicaments. De plus, même relativement caractéristiques biochimiques de base de la protéine, telle que l'état oligomère fonctionnel, des protéines interagissant et l'activité ATPase restent mal caractérisés. Nous avons précédemment rapporté un protocole pour l'expression à grande échelle de la GFP-CFTR et murine His-taggeddans S. cerevisiae 14 et maintenant décrire plus avant les protocoles pour la purification de la protéine CFTR. Nous avons utilisé ces méthodes pour purifier les cinq orthologues de la protéine CFTR, et des données présentes pour la purification de la protéine CFTR de poulet, par exemple. La sélection des détergents pour la solubilisation et la purification est une étape critique dans la purification de toute protéine de la membrane. Après avoir examiné de la solubilité de la protéine CFTR dans plusieurs détergents, nous avons choisi deux détergents contrastants pour une utilisation dans la purification. Dodécyl-β-D-maltoside (DDM) est un détergent non ionique qui a été largement utilisé à la fois pour des études structurales et fonctionnelles des protéines de membrane de 15 à 21. Le détergent ionique 1-tétradécanoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (LPG-14) est très efficace dans la solubilisation de la protéine CFTR et a déjà été utilisé dans la purification de protéines membranaires fonctionnelles 10, 22,23, y compris la purification de la protéine CFTR à partir de S. 24 cerevisiae. </ P>
Nous avons précédemment décrit un procédé pour la surexpression de la protéine CFTR murine 14. Depuis la publication de ce protocole, nous avons exprimé et purifié plusieurs orthologues différents de CFTR en utilisant le même système. Tous les orthologues testés jusqu'à présent bien purifiés dans le détergent pour le GPL, tandis que la purification DDM a montré une plus grande variation entre les différents orthologues (données non présentées). Cette flexibilité illustre la force de l'approche de la levure: il est possible de dépister de nombreuses constructions avec rapidité relative afin de sélectionner un à un usage particulier.
Le lavage des microsomes de levure avec un tampon contenant 1 M de NaCl avant la solubilisation avec des résultats DDM dans une préparation de microsomes de nettoyage et de réduire les contaminants à des stades ultérieurs. Cette étape n'est pas nécessaire dans le protocole de GPL comme l'échantillon de CFTR finale est> 90% pure, sans le lavage de microsomes. En outre, la purification dans DDM nécessite plusieurs modifications des tampons pour la solubilisation d'unnd purification, à savoir l'ajout de glycérol et de sel supplémentaire. Ensemble, ces additions considérablement augmenté la liaison de la protéine de DDM-solubilisé à la colonne.
La méthodologie de purification DDM a des possibilités d'amélioration, notamment l'élimination d'un contaminant majeur de 40 kDa qui, évaluée par spectrométrie de masse, est due à la sous-unité ribosomique L3 levure, qui semble avoir une affinité inhérente de la résine de nickel. Il n'y a pas de séquence polyHis évident dans la protéine L3, mais l'examen de la structure 3D lorsqu'il est lié au ribosome (PDB = 1FFK) montre que la sous-unité L3 pliée a une grappe des polyHis potentiel. Que ce groupe est moins problématique en matière de GPL-purifié peut être dû à la lessive de GPL sévère.
Bien que la purification dans DDM semble être plus faible que celle en GPL, détergents doux tels que DDM peuvent être plus compatible avec les analyses fonctionnelles et structurelles et ont déjà été utilisés dans plusieurs Crystall X-rayographiques études de protéines membranaires de 15 à 21. En outre, nos résultats indiquent que l'utilisation du GPL conduit à la perte de la fonction ATPase dans CFTR par rapport à la purification dans DDM. Par conséquent, nous recommandons le protocole de purification à base de GPL pour la production de la protéine CFTR, où la pureté est essentiel, par exemple dans des applications telles que la caractérisation des modifications post-traductionnelles, ou dans la génération d'anticorps, le protocole à base de GPL-serait choisi . D'autre part dans les applications où l'activité et l'état entièrement native de la protéine est essentielle, nous proposons le protocole basé DDM, comme une meilleure option.
Pour conclure, ce protocole décrit une méthode reproductible pour l'isolement de la protéine CFTR dans le détergent GPL-14 ou le détergent non-ionique DDM zwitterionique. Comme tel, il indique une plus grande gamme de conditions de purification pour CFTR que nous avons déjà communiqués 10-13. En outre milligramme quantités de CFTR purifié peuvent êtreobtenu à l'aide de ces procédures lorsqu'il est combiné avec un système de croissance de la levure à grand volume, tel qu'un fermenteur de 20 L et un système de récolte des cellules de grande capacité tel qu'un 6 L faible vitesse de rotor de centrifugeuse. Le CFTR obtenu présente une étiquette de GFP clivable qui permet une surveillance facile de la protéine dans les divers dosages biochimiques et biophysiques.
Le réactif décrit dans ce manuscrit (poulet de plasmide contenant CFTR ou des cellules de levure congelés) peut être obtenu par la Cystic Fibrosis Foundation (Etats-Unis).
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par les États-Unis Cystic Fibrosis Foundation (CFF) à travers sa structure Consortium CFTR 3D. TR a été financée par une bourse UK CF Trust, et NC par une bourse au Royaume-Uni BBSRC. Nous reconnaissons nos collègues de la structure consortium CFF CFTR 3D pour leur aide et des conseils et de la conception de la séquence de la protéine CFTR poulet et de purification des tags de codons optimisés.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |