Identification de nouveaux gènes associés à la production d'alginate dans<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Utilisation de Mini-<em> Himar1</em> Mutagenèse Mariner Transposon médiation
Summary
Ici, nous décrivons un protocole en utilisant la mini-himar1 marin mutagenèse de transposon médiation pour générer une bibliothèque de mutants d'insertion à haute densité à l'écran, isoler et d'identifier de nouveaux régulateurs d'alginate dans le prototype Pseudomonas aeruginosa souche PAO1.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif de l'environnement avec des capacités métaboliques polyvalents. P. aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste qui établit des infections pulmonaires chroniques chez les patients atteints de fibrose kystique (FK). La surproduction d'un polysaccharide capsulaire appelé alginate, également connu sous le nom mucoidy, favorise la formation de biofilms mucoïdes qui sont plus résistants que les cellules planctoniques antibiotique et à la chimiothérapie défenses de l'hôte. En outre, la conversion de la non mucoïde au phénotype mucoïde est un marqueur clinique pour le début de l'infection chronique à CF. Surproduction alginate par P. aeruginosa est un processus endergonic qui impose lourdement énergie cellulaire. Par conséquent, la production d'alginate est très réglementé dans P. aeruginosa. Afin de mieux comprendre la régulation de l'alginate, nous décrivons un protocole à l'aide du mini-transposon himar1 mutagenèse pour l'identification de nouveau régulateur d'alginates dans une souche PAO1 prototype. La procédure se compose de deux étapes de base. Tout d'abord, nous avons transféré la mini-himar1 transposon (PFA) de l'hôte E. coli dans SM10/λpir destinataire P. aeruginosa PAO1 par conjugaison biparentale pour créer une bibliothèque de mutants d'insertion à haute densité, qui ont été sélectionnés sur des plaques de gélose Pseudomonas d'isolation additionné de gentamycine. En second lieu, nous avons criblé et isolé les colonies mucoïdes pour mapper le site d'insertion par PCR inverse en utilisant des amorces d'ADN pointant vers l'extérieur à partir de la cassette de la gentamycine et de séquençage de l'ADN. En utilisant ce protocole, nous avons identifié deux nouveaux régulateurs d'alginate, MUCE (PA4033) et kinB (PA5484), à souche PAO1 avec un type sauvage Muca codant pour le facteur anti-sigma Muca pour le régulateur de l'alginate de maître ALGU (ALGT, σ 22) . Ce protocole de mutagenèse à haut débit peut être modifié pour l'identification d'autres gènes liés à la virulence causant le changement dans la colomorphologie ny.
Introduction
La capacité de la opportuniste, agent pathogène Gram négatif Pseudomonas aeruginosa à la surproduction de l'alginate est un facteur majeur dans sa capacité à établir un film biologique. La surproduction d'alginate est un phénotype souvent dénommé mucoidy. L'isolement des colonies mucoïdes de crachats de personnes atteintes de fibrose kystique (FK) est indicative d'une infection chronique, et est directement associée à une baisse générale de la santé du patient 1. Actuellement, il est entendu que la régulation de la production et de l'alginate dans P. aeruginosa se produit principalement à deux opérons. Le premier est l'opéron de biosynthèse de l'alginate, qui contient 12 gènes (ALGD – alg8 – alg44 – algK – Alge – algG – Algx – algL – ALGI – algJ – algF – algA) qui sont responsables de la synthèse et de l'exportation du polymère d'alginate dans le périplasme de la environme extracellulairent 2-5. La deuxième opéron est un groupe de gènes en commençant par le facteur sigma alternatif ALGU / T et en continuant avec Muca, mucB, et mucD. ALGU / T est un régulateur positif, tandis que mucAB-D sont classés en tant que régulateurs négatifs de la production d'alginate 6-8. En outre, les régulateurs de la transcription, tels que ALGB, AlgQ, ALGr, et rpoN, ainsi que post-transcriptionnel et la modification post-traductionnelle par le contrôle de la répression catabolique, l'activité kinase (KinB) et la protéolyse intramembranaire, se sont également avérés être impliqués dans l'alginate réglementation 9-14.
Le vecteur de transposon mini-himar1 appelé PFA a été créé à l'origine dans le laboratoire du Dr Mekalanos à Harvard Medical School 15. Le plasmide PFA est constitué d'un élément transposable flanqué de deux répétitions inversées de 27 pb et une cassette de résistance à la gentamycine dans le milieu (aacC1: 534 pb), un gène codant pour la hyperactive transposase mariner 16, et un codage de β-lactamase de gène (bla) (figure 1). L'information de séquence pour les éléments transposables du PFA est disponible au numéro d'accession GenBank: DQ366300 13. Dans PFA, il existe un site de clonage multiple (MCS) derrière le gène aacC1 qui est utilisé pour l'identification du site d'insertion chromosomique en utilisant une PCR inverse. Un avantage majeur à l'utilisation du transposon mini-himar1 a pas de facteurs de l'hôte spécifiques sont nécessaires pour la transposition (mutagenèse). En outre, il existe une grande abondance de sites d'insertion de dinucléotides TA trouvés dans le génome de P. aeruginosa. Par exemple, AT sites d'insertion dinucléotide se produit 94 404 et 100 229 fois dans le PAO1 (6264404 bps, numéro d'accession GenBank NC_002516.2) et PA14 (6537648 bps; numéro d'accès GenBank NC_008463) génomes, respectivement. En raison de l'abondance de dinucléotide TA dans le génome, d'un mini-himar1 </em> Transposon peut provoquer la densité élevée et une mutagénèse aléatoire, ce qui est particulièrement appropriée pour l'analyse des gènes de virulence et des gènes qui sont fortement réglementés. Théoriquement, le transposon mini-himar1 peut insérer dans tout gène non essentiel dans le génome de P. aeruginosa. Ceci permet d'obtenir environ 18 sites d'insertion par TA cadre ouvert de lecture dans le génome de PAO1.
Ici, nous décrivons un protocole utilisant des mini-transposon himar1 médiation mutagenèse pour identifier de nouveaux régulateurs de mucoidy dans P. aeruginosa. Plus précisément, nous biparentally conjugué du vecteur PFA contenant un transposon mini-himar1 de E. coli SM10/λpir dans le non mucoïde prototrophique souche PAO1. Après que le transposon est intégré dans le génome, la souche réceptrice est mise en culture sur gélose Pseudomonas isolement (PIA) contenant du triclosan qui inhibe la croissance de E. coli. Ainsi, une banque de mutants d' <em> P. aeruginosa peut être sélectionnée par la croissance de la plaque PIA supplémenté avec de la gentamycine et de la présence du phénotype mucoïde. Remarque, un transposon médiation contre un mutant d'intégration véritable aura un phénotype résistant et carbenicilline sensible gentamicine. Dans cette étude, environ 80 000 mutants d'insertion de PAO1 ont été isolés au moyen de quatre conjugaisons séparées. Nous avons ensuite projeté pour les isolats mucoïdes, et déterminé le site d'insertion par l'enzyme de restriction digestion, ligature et PCR inverse. Nous avons effectué une analyse par transfert de Southern avec la cassette de résistance à la gentamycine comme une sonde pour voir le nombre d'insertion par génome. Nous avons déterminé que plus de 90% des mutants obtenus par conjugaison en utilisant ce protocole n'avait qu'une seule copie du himar1 dans le génome et affiché le phénotype résistant et carbenicilline sensible gentamicine. Un total de 32 isolats muqueuses ont été identifiés, 22 d'entre eux ont été cartographiés à différents loci du P. aeruginosa PAO1chromosome. Ce taux d'insertion prévoit une couverture suffisante pour identifier plusieurs nouveaux régulateurs de surproduction alginate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est important de noter que ce procédé peut être utilisé dans d'autres espèces de Pseudomonas avec ces altérations: incuber P. fluorescens et P. putida à 30 ° C, et P. stutzeri à 42 ° C; P. stuzeri doit être mis en culture sur des plaques LB supplémenté avec 150 ug / ml de gentamycine, à l'étape 1.11, P. stutzeri cellules doivent être transférés dans 500 pl de LB au lieu de 1 ml. En outre, il ya deux étapes essentielles de ce protocole. T…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la NASA en Virginie occidentale espace Grant Consortium NASA (National WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) et NIH P20RR016477 et P20GM103434 au réseau IDeA Virginie-Occidentale pour l'excellence en recherche biomédicale. Nous remercions Vonya M. Eisinger pour l'assistance technique à ces travaux.
Materials
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
Referências
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