Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em> C. elegans</em

1. C. elegans crescita Preparare 35 millimetri Nematode crescita media (NGM) piastre di agar seminate con i batteri OP50, come da metodi di coltivazione standard di 1. Sincronizzare C. elegans, ponendo 6 adulti gravide su un piatto NGM seminato. Rimuovere il numero di adulti dopo ~ 100 uova sono state fissate (~ 3 ore). Incubare le piastre per 3 giorni a 20 ° C, a quel punto i vermi avranno sviluppato a giovani stadio adulto e sono ottimali per questo esperimento. Protocolli alternativi per sincronizzare C. elegans sono descritte altrove 10. 2. Materiali per AS M9 tampone (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) deve essere depurata di ossigeno equilibrando con N 2 (argon può anche essere usato) durante 30 min prima dell'esperimento e tenuto circondato da ghiaccio. Fai un piccolo foro (3 millimetrilarghezza) nel coperchio di 1,5 ml provette da microcentrifuga in cui i vermi saranno collocate durante AS. Il foro permette lo scambio di gas senza tenere il coperchio aperto, in quanto questo può portare a eccessiva della carta evaporazione. 3. Anossia / fame Condurre tutti gli esperimenti, almeno in triplicato. Aggiungere 1 ml di tampone RT, M9 ossigenato per ogni placca 35 mm avente vermi adulti giovani coltivate come descritto sopra. Fare attenzione a non rimuovere i batteri dalla piastra (aggiungere M9 ai bordi dove i batteri non sono state seminate). Dopo circa 1 min i vermi dovrebbero essere nuotare nella M9. Cappotto un puntale da 1 ml con BSA pipettando ed espellendo una soluzione sterile BSA 1%. Inclinare con cautela il piatto contenente i vermi in un tampone M9, rimuovere la M9 dallo stesso luogo in cui è stato aggiunto, e posizionare la sospensione nei tubi microcentrifuga preparati. Far riposare in ghiaccio fino i vermi siano depositati sul fondo delle provette (~ 1-2 Min). Rimuovere la quantità massima di M9 possibile senza disturbare i vermi dal tubo (lasciando circa 100 ml), aggiungere 1 ml di M9 ossigeno purgato e ghiacciata e posizionare il tubo sul ghiaccio fino a quando i vermi si depositano sul fondo di nuovo. Ripetere l'ultimo passaggio 3x. In ultimo lavaggio, rimuovere la M9 fino ~ 100 microlitri rimane nel tubo. Mettere le provette con i vermi in deoxygenated M9 all'interno di una camera anossica / ipossia (vedere le istruzioni qui di seguito, Sezione 3.6.1) o, in alternativa, in un contenitore sigillato personalizzato (vedi istruzioni qui sotto, sezione 3.6.2). Se una camera anossica / ipossica commerciale deve essere utilizzato, lasciare alcune M9 spurgato all'interno della camera prima di iniziare la fase 3.5 e ripetere il punto 3.5 una volta che i vermi sono all'interno della camera. Se una camera personalizzato deve essere utilizzato, una descrizione dettagliata di come creare un apparecchio a basso costo è presentato alla fine di questo protocollo ed è stato descritto da un altro gruppo in precedenza 11. In breve: <ol> Fare due fori in un coperchio da 250 ml Tupperware-tipo di contenitore e aggiungere connettori per tubi a loro. Uno sarà utilizzato per iniettare la miscela di gas mentre l'altro sarà l'uscita gas in un bagno d'acqua. Posizionare i vermi nella camera e sigillare la camera con il coperchio. Gas con un costante flusso di N 2 (100 ml / min). Porre il contenitore in un bagno di acqua a 26 ° C. Assicurarsi che il tubo di uscita è ben immerso in acqua così non ritorni vie e che non vi siano perdite nel sistema (apparente da bolle derivanti dalla camera stessa). Incubare i vermi a 26 ° C per 20 ore. 4. Riperfusione simulata Dopo 20 ore in condizioni di AS, rimuovere i tubi dalla camera di incubazione in aria ambiente. Pipetta C. elegans con una punta BSA rivestito (come al punto 3.3) su un OP50 testa di serie 35 millimetri piastra NGM. Incubare le piastre a 20 ° C per 24 ore.Dopo questo, i vermi saranno pronti per essere segnato. 5. Identificare Morto Versus Live Worms Utilizzando un pick platino, toccare leggermente la parte superiore della testa della vite senza fine. Vermi vivi si sposteranno indietro dopo essere stato toccato. Se i vermi sono nonresponsive, segnare come morto. Occasionalmente, un verme non si muoverà all'indietro, ma può presentare un leggero movimento della testa da lato a lato. Anche se non è tecnicamente morto, questi vermi sono quasi certo di scadenza entro poche ore, e dovrebbero essere classificati come morti. Se si aspetta troppo tempo per segnare i vermi, schiusa interna della progenie può accadere e queste "borse-di-vermi" può rompersi, facendo rilevare le carcasse molto difficile. Rimuovere entrambi i vermi vivi e morti dalla piastra se essi sono computati al fine di evitare conteggi doppi. I vermi vivi possono essere spostati in un piatto a parte per eseguire test comportamentali. La quantità di vermi viventi relativi al totale è rappresentato come la% di vermi sopravvissuti (Figura 1A </strong>). 6. Toccare risposta Assay Una descrizione dettagliata di questo protocollo è stato presentato in Hart, Anne C., ed. Comportamento (3 luglio 2006), WormBook, ed. La C. elegans Comunità di Ricerca, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. A segnare per la risposta al tocco, identificare i vermi che si muovono e toccano leggermente il lato della testa del verme (vicino alla parte centrale della faringe) con uno scalpello ciglio (Figura 3). Se il worm si muove indietro, segnare come reattivo, se non, segnare come non risponde (Figura 1B). Ripetere questa operazione 10-15x per ogni vite senza fine con intervalli di 10 secondi. Sonda almeno 10 vermi in ogni gruppo per avere dati precisi. Lo stesso test può essere utilizzato per valutare i cambiamenti in avanti locomotore seguente tocco leggero alla parete posteriore del corpo. Fare attenzione a non toccare la testa o la coda del verme, dal momento che questo stimola un comportamento diverso. Infine, inceppi di controllo genetico aziendali [N2 Bristol wild-type per il positivo, mec (mechanosensory) mutante di negativo – ad esempio CB1338 mec-3 (e1338) IV] per calibrare la forza con cui a toccare i vermi. Troppo dura di una stimolazione sarà suscitare una risposta comportamentale in mutanti MEC, troppo poco non si suscitare un effetto nei controlli N2 tipo selvatico. 7. Neuronale modifiche Per visualizzare Post come modificazioni neuronali, utilizzare un ceppo che esprime GFP in-rispondere al tocco MEC neuroni 4,5. Questi neuroni sono lunghi processi che corrono lungo la parete del corpo e sono facilmente segnati per anomalie morfologiche. Inoltre, l'informazione morfologica può essere integrato con misure comportamentali di funzione neuronale, come descritto sopra. Un ceppo che può essere utilizzato per questo scopo è TU2583, che è disponibile dalla C. elegans Genetics Center e contiene il transgene integrato uIs25 che esprimono GFP from il mec-18 promotore o, in alternativa TU2562, che contiene un mec-3 :: GFP fusion integrata. Preparare un pad agarosio. Sciogliere 2% agarosio in acqua, portare a 1x M9 con uno stock 10x, e mantenere la soluzione a 70 ° C. Una goccia (~ 20 microlitri) di questa soluzione in un vetrino (25 mm x 75 mm) che è stato inserito tra altri due slitte, ognuna delle quali ha un unico pezzo di nastro sul loro lato inferiore. Posizionare un vetrino finale perpendicolare alla prima sulla superficie della soluzione di agarosio al 2%, e lasciate raffreddare a temperatura ambiente. Questo dovrebbe formare un pad che è lo spessore del nastro. Rimuovere la slitta superiore e aggiungere 10 ml di M9 contenenti 0,1% Tetramisole, che immobilizzare i vermi. Spostare alcuni (~ 10) vivere vermi sul 2% agarosio diapositiva. Posizionare un vetrino su di loro e visualizzare GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza in un obiettivo 100X con l'illuminazione adeguata. Danneggiatoneuroni mostrerà una stringa citosolico membrana del reticolo perle nei processi, composto punctum multiple (Figura 2A), e / o anomalie in cui i processi sembrano essere ignorate (Figura 2B). Conte punctum e le anomalie in entrambi i neuroni per ogni verme, con un totale di almeno 10 vermi. 8. Lab-made Hypoxic Camera Uno stile Tupperware, richiudibile, contenitore chiuso ermeticamente può essere retrofit come una camera anossica. Fare attenzione a scegliere un contenitore che è il più piccolo possibile. Un piccolo contenitore crea un ambiente ipossico più veloce ed è più facile da montare nel bagno d'acqua (Figura 4). Fai due fori sul coperchio (può essere fatto con un cacciavite o riscaldando pinze e costringendo nel coperchio) e inserire un connettore di plastica o di metallo che si inserisce il tubo (Figura 5A). Utilizzare colla che può essere posizionato sotto l'acqua, e diventa difficile anche dopo essiccamento, evitando di movimentoil connettore e quindi riducendo la possibilità di perdite (Figura 5B). Il contenitore deve essere collocato nella vasca d'acqua in modo che sia completamente sommerso (Figura 4). Per immergere il contenitore, utilizzare un peso bottiglia o un peso immersioni. Uno dei raccordi dei tubi saranno utilizzati per introdurre una miscela di gas e l'altro tubo fungerà da sovrappressione, quindi, andrebbe lasciata sotto l'acqua in modo che il contenitore è sigillato rispetto all'ambiente esterno (Figura 4). La composizione dell'aria può essere modulata utilizzando il gas su misura, controllori di flusso di massa o di qualsiasi apparato che mescola i gas desiderati. Il flusso di gas deve essere controllato, come flusso elevato può creare eccessiva evaporazione. Ad esempio, in un contenitore da 250 ml, 100 ml / min di gas fornirà buon spazio per i vermi e un flusso adeguato. La lunghezza del tubo deve essere ridotto al minimo, in quanto possono essere permeabile ai gas, unallowing l'ingresso di O 2. È importante evitare l'uso di silicone, Tygon provette come questi materiali sono permeabili scambio di gas. Noi preferiamo tubi di polipropilene o nylon. Vetro o tubi di metallo mantengono i gas bene, ma sono anche più difficili da lavorare.