Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em> C. elegans</em

Une. C. elegans croissance Préparer 35 mm nématode croissance médias (NGM) des plaques de gélose ensemencées avec des bactéries OP50, que par les méthodes de culture standards 1. Synchroniser C. elegans en plaçant 6 adultes gravides sur une plaque NGM graines. Retirez les adultes après ~ 100 œufs ont été pondus (~ h de 3). Incuber les plaques pendant 3 jours à 20 ° C, à quel point les vers se sont développées en stade jeune adulte et sont optimales pour cette expérience. Des protocoles alternatifs pour synchroniser C. elegans sont décrits ailleurs 10. 2. Matériaux pour AS Tampon M9 (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM de NaCl, 1 mM de MgSO 4) doit être purgé de l'oxygène par équilibrage avec du N2 (argon peut aussi être utilisé) pendant 30 min avant l'expérience et entretenu, entouré de glace. Faire un petit trou (3 mmde large) dans le couvercle de 1,5 ml microtubes dans lequel les vers seront placés durant AS. Le trou permet l'échange de gaz sans garder le couvercle ouvert, car cela peut conduire à l'évaporation excessive des médias. 3. Anoxie / famine Effectuer toutes les expériences au moins en triple exemplaire. Ajouter 1 ml de tampon de RT, M9 oxygénée à chaque plaque de 35 mm contenant jeunes vers adultes cultivés comme décrit ci-dessus. Soyez prudent pour éviter l'élimination des bactéries de la plaque (M9 ajouter aux bords où les bactéries ont été ensemencées pas). Après ~ 1 min les vers doivent être nagent dans le M9. Manteau un embout de pipette de 1 ml avec de la BSA par pipetage et à expulser une solution stérile de la BSA à 1%. Incliner délicatement la plaque contenant les vers dans un tampon M9, retirez le M9 de l'endroit même où il a été ajouté, et placer la suspension dans les microtubes préparés. Laisser reposer dans la glace jusqu'à ce que les vers ont chuté au fond des tubes (~ 1-2 Min). Retirez le maximum de M9 possible sans perturber les vers du tube (en laissant environ 100 pi), ajouter 1 ml de la M9 oxygène purgé et glacé et placer le tube sur la glace jusqu'à ce que les vers se déposent au fond de nouveau. Répétez la dernière étape 3x. Dans le dernier lavage, retirer le M9 jusqu'à ~ 100 pi reste dans le tube. Placer les tubes avec les vers dans désoxygéné M9 l'intérieur d'une chambre anoxique / hypoxique (voir les instructions ci-dessous, la section 3.6.1) ou, à défaut, dans un récipient scellé personnalisé (voir les instructions ci-dessous, la section 3.6.2). Si une chambre de anoxique / hypoxique commercial doit être utilisé, laissez un M9 purgé l'intérieur de la chambre avant l'étape 3.5 de départ et répétez l'étape 3.5 une fois que les vers sont dans la chambre. Si une chambre personnalisée doit être utilisé, une description détaillée de la façon de créer un appareil à faible coût est présenté à la fin de ce protocole et a été décrit par un autre groupe auparavant 11. En bref: <ol> Faites deux trous dans un couvercle de 250 ml contenant Tupperware-type et ajouter des connecteurs de tubes pour eux. L'un servira à injecter le mélange gazeux alors que l'autre sera la sortie de gaz dans un bain d'eau. Placer les vers dans la chambre et fermer la chambre à l'aide du couvercle. Gaz avec un flux constant de N2 (100 ml / min). Placer le récipient dans un bain-marie à 26 ° C. Assurez-vous que le tube de sortie est bien immergé dans l'eau donc pas de retour d'air et qu'il n'y a pas de fuites dans le système (apparente par des bulles provenant de la chambre elle-même). Incuber les vers à 26 ° C pendant 20 heures. 4. Reperfusion simulée Après 20 heures sous conditions, retirer les tubes de la chambre d'incubation dans l'air ambiant. Pipette C. elegans avec une pointe BSA enduit (comme dans l'étape 3.3) sur un OP50 ensemencé 35 mm de plaque NGM. Incuber les plaques à 20 ° C pendant 24 heures.Après cela, les vers seront prêts à être marqué. 5. Identifier les morts Versus vers vivants Avec une pointe de platine, toucher légèrement le dessus de la tête de la vis sans fin. Vers vivants se déplacent vers l'arrière après avoir été touché. Si les vers sont répondaient pas, marquer comme mort. De temps en temps, un ver ne sera pas revenir en arrière, mais peut présenter un léger mouvement de la tête d'un côté à côté. Bien que pas techniquement mort, ces vers sont presque certains d'expirer dans quelques heures, et devraient être marqués comme mort. Si l'on attend trop longtemps pour marquer les vers, l'éclosion interne de la descendance peut se produire et ces «sacs-de-vers" peut se rompre, ce qui rend la détection des carcasses très difficile. Retirez les deux vers vivants et morts de la plaque, ils sont pris pour éviter des comptes dupliqués. Les vers de terre vivants peuvent être déplacés vers une plaque séparée pour effectuer des essais de comportement. La quantité de vers vivants par rapport au total est représenté comme le% de vers survivants (figure 1A </strong>). 6. Touchez Essai de réponse Une description détaillée de ce protocole a été présenté dans Hart, Anne C., ed. Comportement (Juillet 3, 2006), WormBook, éd. Le C. Communauté elegans recherche, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. Pour marquer la réponse au toucher, identifier les vers qui se déplacent et appuyez légèrement sur ​​le côté de la tête de la vis sans fin (près de la partie centrale du pharynx) avec un pic à cil (figure 3). Si le ver se déplace vers l'arrière, marquer le plus sensible, si pas, marquer comme non (figure 1B). Répétez cette étape 10-15x pour chaque ver avec des intervalles de 10 sec. Sonder au moins 10 vers dans chaque groupe de disposer de données précises. La même analyse peut être utilisée pour évaluer les changements avant de locomotion suivante légère touche à la paroi postérieure du corps. Veillez à ne pas toucher la tête ou la queue du ver, car cela stimule un comportement distinct. Enfin,souches génétiques de contrôle des sociétés [de type sauvage N2 Bristol, mec (mécano) mutant positif pour le négatif – par exemple CB1338 mec-3 (e1338) IV] pour calibrer la force avec laquelle toucher les vers. Trop dur d'une stimulation seront obtenir une réponse comportementale chez les mutants de mec, trop peu ne sera pas obtenir un effet dans les contrôles N2 type sauvage. 7. Neuronale modifications Pour visualiser poste AS modifications neuronales, utiliser une souche qui exprime la GFP dans les neurones mec tactiles répondant 4,5. Ces neurones ont un long processus qui courent le long de la paroi du corps et sont facilement avantage des anomalies morphologiques. En outre, l'information morphologique peut être intégré avec les mesures comportementales de la fonction neuronale, tels que décrits ci-dessus. Une souche qui peut être utilisé à cette fin est TU2583, qui est disponible auprès de la C. elegans Centre de Génétique et contient le transgène intégré de uIs25 exprimant la GFP vientm le promoteur mec-18, ou en variante TU2562, qui contient un mec-3 :: GFP fusion intégré. Préparer un tampon d'agarose. Faire fondre 2% d'agarose dans l'eau, porter à 1x M9 avec un 10x stock, et maintenir la solution à 70 ° C. Déposer une goutte (~ 20 ul) de cette solution sur une lame de verre (25 mm x 75 mm) qui a été placé entre deux autres diapositives, chacun d'eux ayant un seul morceau de ruban adhésif sur leur côté inférieur. Placer une lame de verre finale perpendiculaire à la première au-dessus de la solution d'agarose à 2%, et le laisser refroidir à température ambiante. Cela devrait former un tampon qui est l'épaisseur de la bande. Retirer la lame supérieure et ajouter 10 ul de M9 contenant 0,1% tetramisole, qui immobiliser les vers. Déplacez une partie (~ 10) vers vivants sur la lame d'agarose à 2%. Placer une lamelle couvre-objet sur eux et de visualiser la GFP en utilisant un microscope à fluorescence sous un objectif 100X avec un éclairage approprié. Endommagéneurones vont montrer une chaîne cytosolique de la membrane de motif de perles dans les procédés, qui comprend punctum multiple (figure 2A), et / ou des anomalies où les procédés semblent être rompu (figure 2B). Comptez punctum et des anomalies dans les deux neurones pour chaque ver, en utilisant un total d'au moins 10 vers. 8. Lab-fait hypoxique Chambre Un style Tupperware, refermable, contenant hermétique pouvez rajouter comme une chambre anoxique. Prenez soin de sélectionner un conteneur qui est aussi petit que possible. Un petit récipient crée un environnement hypoxique plus rapide et plus facile à tenir dans le bain d'eau (figure 4). Faites deux trous sur le couvercle (qui peut être fait avec un tournevis ou en chauffant forceps et en forçant dans le couvercle) et insérer un connecteur en plastique ou en métal qui s'adapte le tube (figure 5A). Utilisez de la colle qui peut être placé sous l'eau, et obtient également dur après séchage, évitant mouvement dele connecteur et donc de réduire le risque de fuite (Figure 5B). Le récipient doit être placé dans le bain d'eau de sorte qu'elle soit complètement immergé (figure 4). Pour plonger le récipient, utiliser un poids de bouteille ou un poids de plongée. L'un des raccords de tubes seront utilisés pour introduire un mélange de gaz et l'autre tube agira comme un limiteur de pression, d'où il doit être laissé sous l'eau de sorte que le récipient est étanche par rapport à l'environnement extérieur (figure 4). La composition de l'air peut être modulée à l'aide de gaz fait sur commande, des régulateurs de débit de masse ou n'importe quel dispositif qui mélange les gaz souhaités. Le débit de gaz doit être contrôlée, comme à haut débit peut créer une évaporation excessive. Par exemple, dans un ml contenant 250, 100 ml / min de gaz fournira un bon espace pour les vers et un flux approprié. La longueur du tube doit être maintenue à un minimum, car ils peuvent être perméable au gaz, unllowing l'entrée de O 2. Il est important d'éviter d'utiliser du silicone, tubes Tygon que ces matériaux sont perméables aux échanges gazeux. Nous préférons des tubes en polypropylène ou en nylon. Verre ou tubes métalliques maintiennent les gaz bien, mais est aussi plus difficile de travailler avec.