JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

Published: March 03, 2014
doi:
10.3791/51170
, , ,
1BioSentinel Inc., Madison, WI

Summary

מבחני זיהוי עצבי וטולינום BoTest מטריקס (ונט) במהירות לטהר ולכמת ונט מתוך מגוון רחב של מטריצות מדגם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיתור והכימות של ונט ממטריצות הן מוצקות ונוזליות ולהפגין assay עם בוטוקס, עגבניות, וחלב.

Abstract

איתור וכימות של עצבי טוקסין (בונט) מטריצות מורכבות מדויקים הנדרש עבור תרופות, סביבתיות, ובדיקת מדגם מזון. בדיקה המהירה בונט של מוצרי מזון נחוצה במהלך זיהוי פלילי פרוץ, אבחון מטופל, ובדיקות בטיחות מזון תוך נדרשת בדיקות עוצמה מדויקות לייצור מוצרים מבוססי תרופה בונט ובטיחות מטופל. מבדק העכבר בשימוש נרחב לבדיקת ונט הוא רגיש מאוד אך חסר הדיוק ותפוקה הנדרש לבדיקה בונט מהירה ושגרתית. יתר על כן, השימוש של המבדק של בעלי חיים הביא לשיחות על ידי הרשויות הרגולטוריות מוצר תרופה ותומכי זכויות בעלי החיים בארצות הברית ובעולם כדי להחליף את מבדק העכבר לבדיקה בונט. כמה מבחני חוץ גופיית החלפה פותחו שפועלים היטב עם ונט מטוהרת במאגרים פשוט, אבל רובם לא הוכחו כרלוונטי לבדיקה במטריצות מורכבות ביותר. כאן, פרוטוקול לזיהוי שלונט במטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest מוצגת. Assay מורכב משלושה חלקים: החלק הראשון כולל הכנת הדגימות לבדיקה, החלק השני הוא צעד immunoprecipitation באמצעות חרוזים פאראמגנטיים מצופה נוגדן אנטי ונט לטהר ונט מהמטריצה, ואת החלק השלישי מכמת מפרקי החלבונים של ונט המבודדת פעילות באמצעות כתב fluorogenic. הפרוטוקול כתוב לבדיקת תפוקה גבוהה בצלחות 96 היטב באמצעות מטריצות הן נוזליים ומוצקות ודורש כ 2 שעות של הכנה ידנית עם פעמים assay כוללת של 4-26 שעות, תלוי בסוג המדגם, עומס רעלן, ורגישות רצויה. הנתונים מוצגים עבור ונט בדיקות / עם פוספט שנאגרו מלוח, מוצר תרופה, supernatant התרבות, חלב 2%, ועגבניות טריות וכוללים דיון בפרמטרים קריטיים להצלחת assay.

Introduction

neurotoxins טוקסין (BoNTs) הם החומרים הקטלניים ידועים, עם מינונים קטלניים אנושיים תוך ורידי מוערכים ב 1-3 ננוגרם / ק"ג 1,2. שבעה קפסיד דומים מבחינה מבנית של ונט, שכותרתו דרך G, קיימים, כל אחת בהיקף של תחום שרשרת כבד אחראי על תא מחייב, ספיגה, וטרנסלוקציה לתוך cytosol ושרשרת אור שמקודד endopeptidase אבץ 3-5. הרעילות המעודנת של ונט נובעת מ, בין שאר, את כניסתה הספציפית מחייבת ולתוך הנוירונים מוטוריים בצומת neuromuscular 6. פעם בתוך תא העצב, endopeptidase שרשרת אור במיוחד דבק אחד או יותר של N-ethylmaleimide רגיש קולטן מסיס החלבון מצורף גורם (המוקשת) החלבונים דרושים לאיחוי שלפוחית, עיכוב שחרור הנוירוטרנסמיטר ומוביל לשיתוק רפה 7-14. ידוע בכינויו מחלת "בוטוליזם", שיתוק של שרירי סרעפת וצלעי בסופו של דבר התוצאות בונטכשל נשימתי ומוות, אלא אם כן אבחון וטיפול מוקדמים שקיבלו.

בוטוליזם במזון אדם מזוהה לרוב עם ונט קפסיד A, B, E ו-F (בונט /, ונט / B, וכו ') ובדרך כלל תוצאה של הבליעה של מזון מזוהם 15,16, אם כי, כמה מקרים של בוטוליזם פצע דווחו בקרב משתמשים בסמים תוך ורידי 17,18. בארצות הברית, בוטוליזם התינוק כתוצאה מהבליעה של נבגי Clostridium על ידי ילדים מתחת לגיל השנה הוא הצורה הנפוצה ביותר של בוטוליזם 19-21. עם זאת, התפרצויות ונט במזון כתוצאה משימורים הביתה פסולים ועיבוד מזון דווחו הן בארצות הברית והן בחו"ל. בין 2000-2009, לפחות 338 מקרים של בוטוליזם במזון דווחו ברחבי העולם ובם שישה הרוגים 22. היכולת במהירות וברגישות כדי לזהות התפרצויות של בוטוליזם במזון היא אינדיקציה קריטית שיכול לסייע לאבחון מוקדם 23,24. יתר על כן, שיטות זיהוי המאפשרות יעיל וחסכוני ובדיקת מזון שגרתית יובילו לביטחון תזונתי משופר.

הספציפיות עצביות של ונט ומחצית חיים ביולוגיים ארוכים גם עושה את זה טיפולי רב עוצמה. בארצות הברית, תרופות המבוססות על ונט אושרו על ידי מנהל המזון והתרופות אמריקניות לטיפול בבעיות קוסמטיות והפרעות הקשורות לתוקפת כולל קווי glabellar, דיסטוניה צוואר הרחם, מיגרנה, פעילות יתר של שלפוחית, ופזילה. יישומים "מותווים" רבים מתועדים, כוללים טיפולים במינון גבוה לתפקוד שרירים חמור 25-28. כימות הרעלן מדויקת היא קריטית למינון נכון, כמו underdosing עשויה להוביל לטיפול לא יעיל ואילו מינון היתר מעמיד אותם בסיכון לתופעות לוואי שעלול להזיק לחולים. למרבה הצער, אין פרוטוקול assay העוצמה סטנדרטי משותף בין יצרנים, וכתוצאה מכך אי שוויון הגדרת יחידה בין produ תרופה מבוססת ונטCTS 29-31.

הבדיקה סטנדרטית לונט היא מבדק העכבר שבי דגימות ונט המכילה מוזרקות intraperitoneally לעכברים ואת מספר מקרי המוות שנרשם על 1-7 ימים 16,32,33. מבדק העכבר רגיש מאוד עם מגבלות של זיהוי (לוד) של 5-10 pg ונט / 34, עם זאת, חששות אתיים על שימוש בבעלי חיים, את העלות הגבוהה של אנשי הדרכה ותחזוקה של מתקנים לבעלי חיים, פעמים assay ארוכות, וחוסר פרוטוקולים סטנדרטיים הביאו לשיחות לפיתוח, בדיקה סטנדרטית ללא בעלי חיים בונט ושיטות כימות 35-39. לאחרונה, במספר שיטות כימות ונט החלופית פותחו המציעים עכבר או רגישות מבדק ליד העכבר 40-49. שיטות אלו נפוצות שימוש בקרינה, ספקטרומטר מסה, או שיטות החיסוניות ומציעות פעמים assay קצרות משמעותי ממבדק העכבר ללא שימוש בבעלי חיים. ספקטרומטר מסת גישות בשילוב עם techniq החיסוניUES הוצג כדי לזהות ולכמת ונט הכלולות מזון ודגימות מורכבות אחרות, עם זאת, דרישות הכשרת כוח אדם ומגבלת ציוד מיוחד מבחני אלה 50-55. רוב מבחני חלופיים האחרים אינם בקלות החלים על בדיקת מדגם מורכבת או חוסר התפוקה הנדרשת לבדיקה שגרתית בונט. הטבע משתנה מאוד של צמיגות מדגם מזון, pH, תוכן מלח, ומרכיבים מטריצה ​​מציג אתגר קשה במיוחד כאשר מנסה לפתח שיטות assay במבחנה עם רגישות כדי להתאים את העוצמה הקיצונית של ונט. יתר על כן, אפילו מערכות חיץ פשוטות וסבירות יחסית, כגון אלה הנובעים מresuspension של מוצרים תרופתיים המבוססים על ונט, מכילות מלח, אלבומין, וסוכר מייצבים (כלומר חומרים בלתי פעיל) המשפיעים באופן משמעותי במבחנה ונט עוצמה 56. טיהור רעלן נדרש לבדיקת פעילות מדויקת של כל אבל הפשוט ביותר של דגימות 56-59.

BoTest מבחני מטריקס תוכננו לתפוקה גבוהה מהירה, וכימות עקבי של ונט מדגימות מורכבות ביותר באמצעות ציוד נמצאות בדרך כלל במעבדות מחקר 56,60. מבחני אלה משתמשים בחרוזי פאראמגנטיים קוולנטית קשורים לנוגדנים נגד ונט סרוטיפ ספציפי להיקשר ולעקל ונט מתוך מדגם ולאחר מכן להסיר מפריע תרכובות מטריצה ​​על ידי שטיפה. בעקבות שטיפה, פעילות פרוטאוליטי ונט מאוגדת אז לכמת במאגר תגובה מותאמת באמצעות כתב תואם נבדק סרוטיפ ונט. כתבים אלה הם חלבוני fluorogenic המורכב מחלבון ציאן N-מסוף ניאון מחצית (CFP) ונגזר בטרמינל C-צהובה ניאון חלבון מחצית (ונוס) מקושר על ידי מצע ונט, שאריות SNAP25 141-206 או שאריות synaptobrevin 33-94 מהווים / D / עיתונאים / E או B BoTest F / G, בהתאמה 45. מחשוף כתב ידי ונט מנוטר באמצעות העברת אנרגיית התהודה פורסטר (סריג). כאשר tהוא הכתב לא נפגע, עירור של CFP תוצאות בסריג לוונוס, מרווה פליטת CFP ופליטת ונוס מרגשת. מחשוף של הכתב ידי ונט מונע סריג, מה שמוביל לעלייה בפליטת CFP וירידה בפליטת ונוס. הפעילות בונט ואז ניתן למדידת כמותית באמצעות היחס בין פליטת CFP ונוגה. לוד להלן 3 pg אפשרית ממגוון רחב של מזונות באמצעות תבנית צלחת 96 היטב תפוקה גבוהה 56. ניתן להשיג רגישות מוגברת באמצעות כרכי מדגם גדולים יותר מאז assay מאפשר ריכוז של רעלן על פני השטח חרוז.

מבחני מטריקס BoTest לBoNTs A, B, E, ו-F פותחו ונבדקו עם מזון, תרופות, ודגימות סביבתיות 56,60. כאן, אנו מתארים הליכים לביצוע מבחני אלה לצורך זיהוי של ונט במורכבות נמוכה (למשל תרופות, ונט בחיץ) ומורכבות גבוהה (לדוגמא: מזון, איכות סביבה) דגימות. שיטות עיבוד ספציפיותבמשך כמה סוגי מדגם מטופלים בפרוטוקול זה וסוגי המדגם אינו מתוארים כאן בדרך כלל ניתן להתאים באמצעות שילוב של השיטות שהוצגו. הפרוטוקול שפותח ונבדק בונט / אבל להתאמה זנים אל ונט אחרות באמצעות מבחני שלהם כפי שמודגם במקומות אחרים 56,60.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים Assay dithiothreitol 200x הפשרה (DTT), מאגר עקידת 10x מטריקס (10x להלן חיץ עקידה), חיץ 10x נטרול (דגימות לא מאוזנות מזון או pH בלבד), וחיץ 10x תגובת BoTest (להלן 10x תגובה חיץ) בטמפרטורת חדר (RT) ל15 דקות או עד מופשר לחלוטין. ראה לו?…

Representative Results

תרשים המסכם את השלבים בפרוטוקול המתואר מוצג באיור 2. Assay מחייב בין 4-26 שעות כדי להשלים בהתאם לסוג דגימה ורגישות assay רצוי, אבל ~ 2 שעות רק של ידיים על זמן. Assay מתבצע בצלחות 96 היטב ו, תלוי בסוג של מתבצעת בדיקה, מאפשרת בדיקה בשלושה עותקים של עד 20 דגימות לרבות תקנים לכל …

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הליכים לכימות ונט / holotoxin, או supernatant מורכבים, Clostridium תרבות מטריצות מורכבות. הפרוטוקול הוא זהה, עם זאת, כאשר בודקים קפסיד אחרים ונט (למשל ונט / B, E, ו-F) עם מבחני מטריקס 56,60, למרות רגישות assay תשתנה פני קפסיד ומבחנים. פרוטוקול זה אינו לוקח בחשבון…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לח' Olivares וד 'רוגה לדיונים ועצות רבי ערך. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי הפרס NSF SBIR (IIP-1,127,245 לBioSentinel Inc) וחוזה של משרד ההגנה (W81XWH-07-2-0,045 לBioSentinel Inc).

Materials

BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo-Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific  VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek  ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Various N/A Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Various N/A Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing.  Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A  Metabiologics N/A Optional, only required for standardization and quantification purposes 
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Scientific 15036
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. . Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. . AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). , (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. . Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. , (2003).
  36. . Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. , (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test – problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. , (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O’Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).

Tags

Botulinum NeurotoxinBoNTBoTest Matrix AssaysImmunoprecipitationFluorogenic ReporterComplex MatricesPharmaceutical TestingFood SafetyRapid DetectionQuantificationMouse BioassayIn Vitro Replacement Assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image