Neurotossine botuliniche (BoNT) sono le sostanze più letali noti, con via endovenosa dosi letali umane stimate a 1-3 ng / kg ^1,2. Sette sierotipi strutturalmente simili di BoNT, etichettati A a G, esistere, ciascuno costituito da un dominio catena pesante responsabile cella vincolante, assorbimento e traslocazione nel citosol e una catena leggera che codifica una endopeptidasi zinco ^3-5. La tossicità squisita BoNT deriva da, in parte, la sua voce specifica di legame e in motoneuroni a livello della giunzione neuromuscolare ^6. Una volta all'interno del neurone, la endopeptidasi catena leggera specificamente fende uno o più dei solubile N-etilmaleimmide sensibile proteina recettore fattore di attacco (SNARE) proteine ​​necessarie per la fusione delle vescicole, inibendo il rilascio dei neurotrasmettitori e portando alla paralisi flaccida ^7-14. Comunemente conosciuta come la malattia "botulismo", paralisi del diaframma e muscoli intercostali di BoNT in ultima analisi,insufficienza respiratoria e morte a meno che la diagnosi precoce e il trattamento vengono ricevuti.

Origine alimentare umana botulismo è più comunemente associato con BoNT sierotipi A, B, E e F (BoNT / A, BoNT / B, ecc) e solitamente deriva dalla ingestione di alimenti contaminati ^15,16, anche se, diversi casi di botulismo della ferita sono stati segnalati tra gli utenti tossicodipendenti per via endovenosa ^17,18. Negli Stati Uniti, botulismo infantile derivante dall'ingestione di spore di Clostridium dai bambini sotto l'anno di età è la forma più comune di botulismo ^19-21. Tuttavia, focolai di origine alimentare BoNT derivanti da conserviera casa improprio e trasformazione dei prodotti alimentari sono stati riportati sia negli Stati Uniti e all'estero. Tra il 2000-2009, di almeno 338 casi di botulismo alimentare sono stati segnalati in tutto il mondo tra cui sei decessi ^22. La capacità di rilevare rapidamente e sensibilmente focolai di botulismo di origine alimentare è un'indicazione importante che potrebbe aiutare la diagnosi precoce ^23,24. Inoltre, i metodi di rilevamento che consentono di costo-efficacia e analisi degli alimenti di routine porteranno a migliorare la sicurezza alimentare.

Specificità neuronale di BoNT e lunga emivita biologica rende anche un potente terapeutico. Negli Stati Uniti, i farmaci a base di BoNT sono approvati dalla Food and Drug Administration per il trattamento di condizioni cosmetiche e disturbi neuromuscolari legati comprese le linee glabellari, distonia cervicale, emicranie, vescica iperattiva, e strabismo. Numerose applicazioni "off-label" sono documentati, compresi i trattamenti ad alte dosi per gravi disfunzioni muscolo ^25-28. Accurate tossina quantificazione è fondamentale per il corretto dosaggio, come sottodosaggio può portare a un trattamento inefficace mentre sovradosaggio mette i pazienti a rischio di effetti collaterali potenzialmente dannosi. Purtroppo, nessun protocollo di dosaggio potenza standard è condiviso tra i produttori, con conseguente disparità di definizione dell'unità tra produttori farmaco a base di BoNTcts ^29-31.

Il test standard per BoNT è il biotest sui topi in cui BoNT contenenti campioni vengono iniettati per via intraperitoneale in topi e il numero di morti registrati oltre 1-7 giorni ^16,32,33. Il biotest sui topi è molto sensibile, con limiti di rilevabilità (LOD) di 5-10 pg BoNT / A ^34, tuttavia, le preoccupazioni etiche sull'uso degli animali, l'alto costo della formazione del personale e manutenzione degli impianti di polizia, i tempi di analisi lunghi, e la mancanza di protocolli standardizzati portato nelle chiamate a sviluppare standard, privo di animali BoNT prove e metodi di quantificazione ^35-39. Recentemente, diversi alternativi metodi di quantificazione BoNT sono stati sviluppati che offrono mouse o quasi il mouse sensibilità bioassay ^40-49. Questi metodi usano comunemente fluorescenza, spettrometria di massa, o metodi immunologici e offrono tempi di analisi molto più breve dei biotest sui topi senza l'uso degli animali. Spettrometria di massa approcci combinati con Techniq immunologicaUES hanno mostrato di rilevare e quantificare BoNT contenuta negli alimenti e altri campioni complessi, tuttavia, le esigenze di formazione del personale e limite di attrezzature specializzate questi saggi ^50-55. La maggior parte degli altri test alternativi non sono facilmente applicabili a una prova a campione complessa o non hanno la velocità necessaria per l'analisi di routine BoNT. La natura altamente variabile della viscosità del campione alimentare, pH, contenuto di sale, e costituenti della matrice rappresenta una sfida particolarmente difficile quando si cerca di sviluppare metodi in vitro test con la sensibilità per abbinare l'estrema potenza di BoNT. Inoltre, anche i sistemi tampone semplici e relativamente benigni, come quelli derivanti dalla risospensione dei prodotti farmaceutici a base di BoNT, contengono sale, albumina, zucchero e stabilizzanti (cioè eccipienti) che hanno un impatto significativo in vitro BoNT potenza ^56. È necessaria purificazione tossina per il test dell'attività accurata di tutti, ma il più semplice dei campioni ^56-59.

IlBoTest saggi Matrix sono stati progettati per una rapida, high-throughput, e la quantificazione coerente del BoNT da campioni altamente complessi che utilizzano attrezzature che si trovano comunemente nei laboratori di ricerca ^56,60. Questi saggi usano perline paramagnetiche covalentemente legati ad anticorpi sierotipo-specifici anti-BoNT di legare e sequestrare BoNT su un campione e poi rimuovere composti interferenti matrice mediante lavaggio. Dopo il lavaggio, legato attività proteolitica BoNT viene quindi quantificata in un tampone di reazione ottimizzato utilizzando un giornalista compatibile con il sierotipo BoNT in fase di test. Questi giornalisti sono proteine ​​fluorogeniche costituiti da una proteina fluorescente ciano N-terminale (PCP) frazione e un C-terminale giallo fluorescente derivato proteico (Venere) frazione collegate da un substrato BoNT, residui SNAP25 141-206 o residui sinaptobrevina 33-94 costituisce il BoTest A / E o B / D / giornalisti F / G, rispettivamente, ^45. Reporter scissione da BoNT è controllata mediante Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET). Quando tegli giornalista è intatto, eccitazione del CFP si traduce in FRET a Venere, tempra emissione CFP ed emozionante emissione di Venere. Clivaggio del reporter da BoNT impedisce FRET, portando ad un aumento delle emissioni CFP e diminuzione delle emissioni Venus. Attività BoNT può essere misurato quantitativamente utilizzando il rapporto tra le emissioni PCP e Venus. LOD di sotto del 3 pg sono possibili da una vasta gamma di alimenti utilizzando un formato piastra a 96 pozzetti high-throughput ^56. Maggiore sensibilità può essere ottenuta usando campioni di volume poiché il test permette concentrazione della tossina sulla superficie delle sfere.

I saggi Matrix BoTest per BoNT A, B, E e F sono stati sviluppati e testati con il cibo, farmaceutica e campioni ambientali ^56,60. Qui, descriviamo le procedure per l'esecuzione di questi test per la rilevazione di BoNT a bassa complessità (ad es farmaceutica, BoNT in tampone) e elevata complessità (ad esempio alimenti, ambientale) campioni. Metodi di lavorazione specificiper diversi tipi di campioni sono affrontati in questo protocollo e tipi di campioni qui non descritti possono solitamente essere adattati utilizzando una combinazione dei metodi presentati. Il protocollo è stato sviluppato e testato con BoNT / A, ma è adattabile ad altri sierotipi BoNT utilizzando i rispettivi saggi come dimostrato altrove ^56,60.