Amoebal共存是使用贴壁变形虫以选择性地生长细胞内的病原体能够抵抗吞噬细胞如变形虫和巨噬细胞的细胞培养系统。因此,它代表发现新的传染性病原体的关键工具。 Amoebal富集允许发现其特定的细胞内细菌的新amoebal品种和。
细胞内病原体如军团菌,分枝杆菌和衣原体样生物是难以分离,因为它们往往较差或根本不生长在所有上,通常是用于培养细菌的选择性培养基。由于这个原因,许多这些病原体被发现仅在最近或以下重要的爆发。这些病原体往往与变形虫,它作为宿主细胞,并允许细菌的存活和生长有关。我们打算在这里提供了两种技术,使孤立的细胞内病原体和表征目前临床或环境样品中的示范:在amoebal共培养和amoebal富集。 Amoebal共培养使细胞内细菌的恢复由所研究的样品接种到一个amoebal草坪,可感染并裂解由存在于样品中的胞内细菌。 Amoebal富集使得目前临床或环境样品中变形虫的恢复。钍是可能导致发现新的amoebal物种,但也是新的细胞内细菌在这些变形虫专门生长。总之,这两个技术有助于发现能够在变形虫长出新的细胞内细菌。因为他们的感染变形虫和抵制吞噬能力,这些细胞内的细菌也可能会被巨噬细胞吞噬逃脱,因此,是致病性高等真核生物。
分子诊断来临之前,目前在环境壁龛或临床样品中的微生物经培养他们在不同的选择性培养基,主要是在琼脂培养皿中经常发现。细菌菌落和其代谢活性的表现型,让细菌分类在物种水平。肉汤也可以被用于增加检测的灵敏度。然而,这两种技术不允许该生长缓慢或根本没有在这些介质上的细菌的恢复。这就是为什么分子生物学方法被如此广泛地采用了时下的原因。然而,检测DNA提供了对细菌的生存能力没有线索。另外,相反地,以培养,分子生物学方法不会导致菌株,可以进一步表征。
研究病原体生长不良固体培养基上,或需要细胞生长是复杂的。大多数这些“难以生长”的细菌都讲究不及物动词脱细胞的细菌,经常发现其特征如下,因为它是为嗜肺军团菌的情况下大规模爆发。这种细菌的特点如下,一位美国退伍军人大会期间发生的爆发。多达182人被感染,29死于严重肺炎1,2。后来证明,变形虫是这种细菌的自然宿主,而他们在酒店空调系统和供水网络的存在是在所谓的退伍军人症3爆发的起源。
变形虫是目前全球范围内的土壤,空气,水和人类志愿者(4审查)的鼻腔粘膜分离。这些“自由生活”变形虫一般都划分在自主的环境,但有时可能会侵入许可主机5。通过吞噬作用和随后的溶酶体消化HY上的各种微生物饲料阿米巴drolases 6。许多兼性或专性细胞内细菌能够抵抗消化,从而感染和阿米巴划分为例如军团菌 , 衣原体相关的细菌或分枝杆菌(7审阅和8)。自由生活的阿米巴可能是一个重要的潜在水库已尚未被发现的细胞内细菌。这导致本集团在洛桑实现两个主要的技术,称为amoebal共培养和amoebal富集,这使得不同的群体从不同环境样品9-15隔离了几个新的专性细胞内微生物。
由于变形虫是专业放牧吞噬细胞对细菌,能抵抗吞噬和这些原生生物生长里面的细菌也可能拓殖人的吞噬细胞和致病走向人类。这是部分地显示出对某些衣原体相关的细菌,如Waddlia町ndrophila。 W. chondrophila不仅可以在变形虫而且在一些细胞类型中,如哺乳动物上皮细胞,巨噬细胞,和鱼细胞系16-18成长。该amoebal共培养也出现相关检测细胞内细菌的临床标本19,20,包括大便这是严重污染,不同的细菌种类21。
在这里,我们描述amoebal共培养和amoebal富集的主要步骤,包括:(一)治疗环境或临床标本;变形虫(二)在无菌介质中生长,对大肠杆菌的细菌草坪及(c)选择和表征胞内细菌。
Amoebal共培养和amoebal富集是使许多新的细菌和amoebal物种的隔离有效的方法。用这些方法得到的结果证实了这两种阿米巴变形虫和抗细菌在环境中无处不在,最有趣的是在被认为通过化学处理,如氯化,臭氧控制人为供水网络。 Amoebal共培养和amoebal富集是必不可少的工具来隔离和培养这些潜在的病原微生物,并获得菌株纯培养,才能再进一步研究其生物学和致病性。最近,这种方法被改编为巨病毒…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢箴。伯纳德香格里拉斯科拉的有益的技术咨询和amoebal共培养和amoebal充实有趣的讨论。我们也感谢博士文森特托马斯,他在实施该技术在我们实验室的帮助。
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |